脐带间充质干细胞促进骨愈合的体外实验及临床应用1例

背景：华通胶来源脐带间充质干细胞比成人间充质干细胞更原始,研究表明其端粒酶活性更高、培养倍增时间更短、分化的细胞谱系更广。目的：观察脐带间充质干细胞在体外分化为成骨细胞的能力及治疗骨折不愈合的效果。方法：从脐带Wharton胶获取细胞培养、扩增,取传代细胞行免疫表型测定和成骨细胞诱导分化,并以脐带间充质细胞移植治疗1例骨折感染外露后长期不愈病例。结果与结论：培养细胞形态类成纤维细胞,可长期稳定培养,传代细胞表达间充质干细胞免疫表型,成骨诱导分化的细胞茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,VonKossa染色有钙结节形成。患者采用脐带间充质干细胞混悬液外用4次,肉芽组织迅速增生填满窦道并上皮化,12d创面愈合。说明,脐带间充质干细胞具有高度自我更新能力和分化潜能,能够向成骨细胞分化,将其移植治疗骨不连可以显著改善局部微环境。     

CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景: 掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键.目的: 观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性.方法: 采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞.将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况.结果与结论: 第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性.CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失.说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行.     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状

背景:关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究.目的:建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状.方法:大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力.结果与结论:两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞:原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代:传代扩增两者之间没有差别.免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45.体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力.     

人脐带间充质干细胞诱导成骨及治疗骨缺损

背景:人脐带间充质干细胞在成骨及组织器官修复方面具有更强的扩增能力及低免疫原性,其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其他来源间充质干细胞.目的:观察脐带间充质干细胞诱导成骨及移植治疗骨缺损的临床效果.方法:应用组织块贴壁法提取人脐带间充质干细胞,体外行成骨诱导并通过光镜观察、茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原的表达等证实其体外成骨能力;对临床骨缺损病例行人脐带间充质干细胞移植,移植后定期复查骨缺损部骨痂生长状况. 结果与结论:体外诱导证实人脐带间充质干细胞具有明确的成骨作用.骨缺损患者在人脐带源间充质干细胞移植后2个月X射线见左股骨髁上骨折部位骨块间隙模糊,骨折外周形成明显的骨痂,骨折断端相连,断端骨折线依然存在;移植后3个月见骨痂间已经形成明显骨性连接.证实脐带间充质干细胞具有体外诱导成骨及体内移植修复骨缺损作用.     

脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化

背景:骨髓是目前间充质干细胞的丰要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,脐带作为阈充质干细胞的新来源已经得到广泛关注.目的:探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能.方法:种植法分离和扩增间充质干细胞:用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态:免疫组织化学方法检测其免疫表型:Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、von Kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力.结果与结论:种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12-16 d达70%～80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2 d左右,体外增殖达20代以上:表面标记分析显示:CD44、CD105、CD133、MHC-1呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明:该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力.     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景: 人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞.目的: 体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞.方法: 无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理.倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记.诱导后:检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达.结果与结论: 传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44.诱导后von Kossa染色表现为阳性.碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P<0.05),不同时间点比较21 d最高(P<0.05).RT-PCR显示:诱导组21,28d碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P<0.05).诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达.提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞.     

脐带间充质干细胞的体外分离及生物学特性观察

背景:脐带组织依赖于母体免疫系统的保护,且胚胎自身免疫系统相对不发育、MHC表达低下,故来源于脐带的间充质干细胞的生物学特性已成为目前研究热点.目的:拟在体外分离培养人脐带组织间充质干细胞,并观察其多向分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-10/2007-05在四川大学组织工程重建实验室完成.材料:脐带来源于胎龄37～40周的健康新生儿,由四川大学华西第二医院产房提供.方法:取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6～8 h后灌洗离心,获取细胞后贴壁法分离培养、扩增,细胞呈集落生长后传代.取传至第5代细胞,分别加入成骨、成脂诱导分化培养基.主要观察指标:脐带间充质干细胞的形态、生长状况、表面抗原分子的表达、多向分化潜能.结果:去除血管后获取脐带组织细胞的方法可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落;高表达基质细胞抗原CD29,CD51,CD71,而不表达CD34,CD45及HLA-DR等造血干细胞抗原分子;成骨诱导后茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞率＞85%;成脂诱导后油红O染色示胞浆充满油滴空泡.结论:脐带组织存在具有分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化.     

人脐带间充质干细胞分离和初步鉴定

目的寻找一种高效获得稳定人脐带间充质干细胞的方法。方法采集3例足月剖宫产健康胎儿脐带,剥离血管及外膜得到Wharton’s胶。贴壁培养脐带Wharton’s胶,收集爬出的细胞进行传代,观察细胞形态;取第3代细胞采用流式细胞学检测细胞表面抗原的表达情况;使用成骨、成脂诱导分化的方法对第3代细胞进行分化潜能的鉴定,成骨诱导细胞用茜素红染液染色,成脂诱导细胞用油红O染液染色,并与未诱导分化的细胞进行比较。结果 Wharton’s胶培养10d左右可见梭形细胞从脐带组织逸出,贴壁培养细胞,可见呈放射状或螺旋状生长;流式细胞仪检测结果显示细胞表面抗原CD29、CD44呈高表达,CD34、CD45呈低表达;成脂诱导培养基中细胞油红O染色可见红色脂滴,成骨诱导培养基中细胞茜素红染色可见红色钙质结节,未诱导的细胞未见脂滴及结节样改变。结论贴壁培养的细胞符合间充质干细胞生长的形态,有向成骨、成脂分化的能力;贴壁法培养脐带Wharton胶可得到稳定的间充质干细胞。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征

背景:目前关于脐带源性干细胞的研究主要是针对其多向分化、组织修复方面,而对脐带干细胞的同种异体之间移植免疫学的报道较少.目的:观察体外培养的人脐带间充质干细胞生物学特性、成骨分化潜能及移植免疫学特征.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-11在吉林大学药学院病理学实验室完成.材料:脐带来源于健康产妇足月剖腹产的胎儿,靠近胎儿侧5cm,均征得孕妇同意.方法:应用组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,胰酶消化传代.取传至第5代细胞,加入含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的α-MEM完全培养基进行成骨诱导.另取传至第5代细胞,分别进行正常培养及应用γ-干扰素刺激48 h.主要观察指标:脐带间充质干细胞形态观察、生长曲线分析、免疫表型分析.碱性磷酸酶染色观察细胞成骨分化情况.流式细胞仪检测γ-干扰素刺激后细胞免疫表型变化.结果:培养7 d倒置显微镜下可见组织块边缘出现呈长梭形、多角形或三角形的贴壁细胞,且随时间延长组织块周围细胞数量逐渐增多.第2,5,9代细胞之间的生长曲线无明显变化,培养20代内未见细胞衰老及增殖速度减慢等现象发生.第2代贴壁细胞CD44,CD105均呈阳性表达,CD34,CD45均呈阴性表达.成骨诱导14 d后,碱性磷酸酶染色可见胞核染成均一的淡蓝色.第5代脐带间充质干细胞HLA-ABC呈弱阳性(40.50%),HLA-DR,CD80,CD86呈阴性表达;γ-干扰素刺激48 h后,HLA-ABC阳性率增加至87.44%,HLA-DR,CD80,CD86仍呈阴性表达.结论:人脐带间充质干细胞体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性.     

人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠创伤性脑损伤

背景:脐带间充质干细胞体内移植治疗脑损伤的效果目前尚较少见报道。目的:观察人脐带间充质干细胞移植对大鼠液压冲击脑损伤的治疗作用。方法:从新生儿脐带中分离、培养间充质干细胞。制作中度打击大鼠脑损伤模型。实验分为4组:①脐带间充质干细胞移植组:损伤后原位移植脐带间充质干细胞。②对照组:损伤后原位注射等量DMEN/F12培养基。③单纯损伤组:仅施行损伤。④假损伤组:仅切开头皮及颅骨,不实施机械性损伤。结果与结论:脐带间充质干细胞移植后1～3周,动物神经功能评分较对照组明显改善;4周后,各组动物神经功能评分均恢复正常。免疫组织化学检测表明少部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶,胶质纤维酸性蛋白。与对照组相比,移植组损伤区血管内皮生长因子表达明显增加,凋亡细胞减少。提示脐带充间质干细胞脑内移植有助于促进创伤性脑损伤后的早期功能恢复,这种治疗效果是通过刺激宿主细胞分泌血管内皮生长因子,增加损伤区微血管密度,抑制宿主细胞凋亡等实现的。     

人脐带间充质干细胞的体外分化及对犬外周血淋巴细胞增殖的影响

目的 通过体外实验检测人脐带间充质干细胞的体外多向分化及对犬T淋巴细胞增殖的影响,探讨其作为组织工程种子细胞的可能性.方法 体外培养人脐带间充质干细胞,分别使用含有地塞米松、转化生长因子、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的培养基诱导其成骨、成软骨、成脂肪三系分化后进行染色鉴定,并将经丝裂霉素处理的人脐带间充质干细胞与植物凝集素刺激下的犬外周血T淋巴细胞共培养,5d后多功能酶标仪检测吸光度值.结果 人脐带间充质干细胞体外生长良好,呈长梭形,形态均一,使用成骨、成软骨和成脂培养基分别诱导分化后碱性磷酸酶（ALP）染色、骨钙素免疫细胞化学染色、茜素红染色、亚甲基蓝染色和油红0染色分别呈阳性,人脐带间充质干细胞与犬外周血T淋巴细胞混合组吸光度值较单纯犬外周血T淋巴细胞组吸光度值明显降低.结论 人脐带间充质干细胞具有多向分化能力,并能够抑制犬外周血淋巴细胞的增殖,有望成为创伤组织及骨组织修复的种子细胞.     

人脐带和骨髓源间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响

目的：探讨人脐带间充质干细胞（UCMSCs）与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）在体外对造血干细胞的支持作用。方法分别从人脐带和骨髓中分离、培养间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色等方法对其进行表型鉴定;采用流式细胞仪测定脐血单个核细胞的周期分布,采用甲基纤维素法测定脐血单个核细胞混合集落形成单位（CFU-Mix）,比较 UCMSCs和BMMSCs对脐血单个核细胞细胞周期、CFU-Mix形成能力的影响。结果成功培养获得 UCMSCs和BMMSCs,鉴定结果符合预期;与非共培养组细胞相比,UCMSCs和 BMMSCs共培养均能促进脐血单个核细胞进入增殖周期,并增加其形成CFU-Mix的能力（P＜0．05）,但UCMSCs和BMMSCs共培养组之间比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论成功从人脐带和骨髓组织中培养获得间充质干细胞,两种来源的间充质干细胞均能提高脐血单个核细胞的体外增殖能力及 CFU-Mix形成能力,均具有造血支持作用。     

脐带间充质干细胞移植治疗终末期肝硬化的疗效及安全性

背景:骨髓间充质干细胞移植已应用于治疗终末期肝病并取得一定疗效。目的:观察脐带间充质干细胞治疗终末期肝硬化患者的疗效及安全性。方法:无菌条件下分离培养脐带间充质干细胞,选择60例肝硬化患者,在内科治疗基础上经肝动脉插管进行脐带间充质干细胞移植。结果与结论:移植2,4,8,12周后,患者血清白蛋白、前白蛋白水平逐渐升高(P<0.05),总胆红素、凝血酶原时间明显低于治疗前水平(P<0.05)。移植后患者乏力、腹胀、纳差明显好转,未发生与移植相关的严重并发症。说明脐带间充质干细胞治疗终末期肝硬化安全有效,能改善患者的肝功能、凝血功能及临床症状。     

人脐带问充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨骨缺损的实验研究

目的：通过检测人脐带间充质干细胞的体外多向分化及对兔桡骨骨缺损修复过程的影响,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法体外培养人脐带间充质干细胞,并诱导其成骨、成软骨、成脂肪三系分化后进行染色鉴定,将人脐带间充质干细胞接种于β-磷酸三钙（β-TCP）支架后作为实验组,植入兔桡骨骨缺损模型中,仅植入β-磷酸三钙（β-TCP）作为对照组,于3个月后行X线检查并取材行HE染色,并分别于术后1、2、3个月进行CT值检测,检测其修复效果。结果人脐带间充质干细胞体外生长良好,呈长梭形,形态均一,使用成骨、成软骨和成脂培养基分别诱导培养后碱性磷酸酶染色、骨桥蛋白及骨钙素免疫细胞化学染色、茜素红染色、番红O染色、亚甲基蓝染色和油红O染色分别呈阳性,体内试验中X线检查对照组与实验组均可见材料与周围骨断端相连,HE染色见实验组有新生骨组织形成,对照组则为纤维结缔组织,CT值在1个月和2个月时实验组明显低于对照组（P〈0.05）,3个月时两组结果无明显差异（P〉0.05）。结论人脐带间充质干细胞具有多向分化能力,并能够促进兔骨缺损的愈合过程,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

背景：脐带间充质干细胞是近年来干细胞生物学研究中发现的重要细胞之一,在细胞治疗领域有着良好的应用前景。血小板裂解液对于干细胞的增殖及诱导分化都存在不同程度的有利作用,在一定程度上甚至可以代替甚至优于血清在培养基中的作用。目的：对血小板裂解液结合脐带间充质干细胞的研究作一综述。方法：于万方等中文数据库和PubMed等英文数据库中,以＂脐带,间充质干细胞,血小板裂解液,分化,增殖＂为关键词检索文献,总结脐带间充质干细胞及血小板裂解液的生物学特性和相关临床应用,并汇总有关血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖活性和诱导分化能力影响的研究结果。结果与结论：血小板裂解液对脐带间充质干细胞的增殖活性及诱导分化有正面影响,这使血小板裂解液在干细胞移植治疗中将会起到无可比拟的作用。     

人脐带间充质干细胞移植治疗大鼠创伤性脑损伤

背景：脐带间充质干细胞体内移植治疗脑损伤的效果目前尚较少见报道。目的：观察人脐带间充质干细胞移植对大鼠液压冲击脑损伤的治疗作用。方法：从新生儿脐带中分离、培养间充质干细胞。制作中度打击大鼠脑损伤模型。实验分为4组：①脐带间充质干细胞移植组：损伤后原位移植脐带间充质干细胞。②对照组：损伤后原位注射等量DMEN/F12培养基。③单纯损伤组：仅施行损伤。④假损伤组：仅切开头皮及颅骨,不实施机械性损伤。结果与结论：脐带间充质干细胞移植后1～3周,动物神经功能评分较对照组明显改善;4周后,各组动物神经功能评分均恢复正常。免疫组织化学检测表明少部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶,胶质纤维酸性蛋白。与对照组相比,移植组损伤区血管内皮生长因子表达明显增加,凋亡细胞减少。提示脐带充间质干细胞脑内移植有助于促进创伤性脑损伤后的早期功能恢复,这种治疗效果是通过刺激宿主细胞分泌血管内皮生长因子,增加损伤区微血管密度,抑制宿主细胞凋亡等实现的。     

血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖与分化的影响

背景:脐带间充质干细胞是近年来干细胞生物学研究中发现的重要细胞之一,在细胞治疗领域有着良好的应用前景.血小板裂解液对于干细胞的增殖及诱导分化都存在不同程度的有利作用,在一定程度上甚至可以代替甚至优于血清在培养基中的作用.目的:对血小板裂解液结合脐带间充质干细胞的研究作一综述.方法:于万方等中文数据库和PubMed 等英文数据库中,以"脐带,间充质干细胞,血小板裂解液,分化,增殖"为关键词检索文献,总结脐带间充质干细胞及血小板裂解液的生物学特性和相关临床应用,并汇总有关血小板裂解液对脐带间充质干细胞增殖活性和诱导分化能力影响的研究结果.结果与结论:血小板裂解液对脐带间充质干细胞的增殖活性及诱导分化有正面影响,这使血小板裂解液在干细胞移植治疗中将会起到无可比拟的作用.     

层粘连蛋白促脐带间充质干细胞向成骨细胞分化与黏着斑激酶表达

背景:目前对脐带间充质干细胞的研究集中在分离纯化及药物作用下诱导分化。分化过程中细胞外基质成分的作用及信号通路的关系的研究报道很少。目的:研究层粘连蛋白在脐带间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的作用与黏着斑激酶表达之间的关系。方法:取对数生长脐带间充质干细胞分为4组:层粘连蛋白诱导组:层粘连蛋白质量浓度分别为50,25,5,1mg/L;成骨诱导组:用成骨诱导液处理;复合诱导组:用层粘连蛋白和成骨诱导液处理。对照组:未用层粘连蛋白和成骨诱导液处理。连续培养4周。观察细胞形态、茜素红染色分析钙盐沉积,检测碱性磷酸酶活性,组织化学组化与Westenblot检测ERK1/2、P-ERK、黏着斑激酶的表达。结果与结论:①倒置显微镜下对照组比诱导组细胞胞体呈矮柱状、有短突起彼此相连,核圆形。②茜素红染色细胞形成红色,表现为阳性。复合诱导组比其他组要高、不同时间点比21d钙盐沉积明显增多(P<0.05)。③层粘连蛋白组碱性磷酸酶活性比对照组高、其诱导第7天后作用显著(P<0.05)。层粘连蛋白不同质量浓度组之间碱性磷酸酶活性,差异无显著性意义(P>0.05)。④组织化学组化鉴定ERK、P-ERK、黏着斑激酶表达均与对照比层粘...