创伤弧菌攻击对人脐静脉内皮细胞系的影响

背景:创伤弧菌感染后患者死亡率高达50%以上,且感染后大量创伤弧菌侵入血液之中,而血管内皮细胞是阻挡创伤弧菌进入血管的第一道屏障.目的:观察创伤弧菌对人脐静脉内皮细胞增殖能力和细胞形态的影响.方法:将对数生长期的人脐静脉内皮细胞消化后,调整细胞浓度至5×10~8 cfu/L,依培养基中创伤弧菌细菌浓度不同分为5个组:10~4,10~5,10~6,10~7 cfu/L创伤弧菌组和对照组.对照组不加创伤弧菌,仅用体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基培养.锥虫蓝拒染法检测细胞存活率、MTT法观察创伤弧菌对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,及光镜下观测细胞面积、周长、细胞核的面积、核浆比以及形状不规则指数.结果与结论:随着创伤弧菌作用浓度和时间的增加,人脐静脉内皮细胞的增殖能力逐渐减弱,攻击组细胞的面积和周长,细胞核的面积以及核浆比都比对照组明显增大,形状不规则指数比对照组更偏离.提示创伤弧菌对体外培养的人脐静脉内皮细胞系的增殖有明显的抑制作用,其抑制能力与创伤弧菌作用的浓度和时间有关.     

肝纤维化大鼠血清体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:近年来临床运用骨髓间充质干细胞移植治疗晚期肝纤维化取得了较好疗效,但由于肝源稀少,骨髓干细胞体外分化为成熟肝细胞的技术仍然不成熟.目的:探讨骨髓间充质干细胞体外诱导其分化为肝细胞的可行性.方法:构建大鼠肝纤维化模型,分离、纯化并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,制备正常及肝纤维化大鼠血清,取第3 代骨髓间充质干细胞分组培养,分别加入以下培养基:DMEM+体积分数10%胎牛血清;肝细胞生长培养基(HGM)+体积分数5%胎牛血清;HGM+5%正常大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清;HGM+5%肝纤维化大鼠血清+25 μg 肝细胞生长因子.观察各组细胞形态变化,MTT 法测定细胞生长曲线,采用Realtime-PCR 检测甲胎蛋白和细胞角蛋白18 的表达,溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白水平,ELISA 法检测培养上清液中转化生长因子β1 表达.结果与结论:正常大鼠血清能促进骨髓间充质干细胞的增殖;肝纤维化大鼠血清对骨髓间充质干细胞促增殖作用最好,且能有效诱导其向肝细胞分化,联合使用肝细胞生长培养基能提高分化率.     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的:应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体,研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达,探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法:实验于2003-12/2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvsp1a-enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA-vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA-ires中,构建重组质粒PcDNA-enos-ires-vegf,经酶切,聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后,转染人脐静脉内皮细胞,硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性,免疫组化和荧光双标记及westernblotting检测转染后细胞蛋白水平的表达,Trizol提取总RNA,反转录-聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果:成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30%～40%。结论:双基因表达载体PcD     

尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮和前列环素的影响

目的:观察不同浓度的尾加压素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮、前列环素,以及对一氧化氮合酶活性的影响,进而探讨尾加压素Ⅱ舒张血管的机制。方法:实验于2005-04/08在武汉大学人民医院老年病科实验室完成。根据所加入尾加压素Ⅱ的浓度不同(10-9～10-7mol/L),将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为4组:空白对照组、10-9mol/L组、10-8mol/L组及10-7mol/L组。干预24h后,用化学比色法检测细胞培养上清液中NO2-,NO3-的水平及一氧化氮合酶的活性,用放射免疫法检测碘[125Ⅰ]-6-酮前列腺素F1α的水平。结果:①一氧化氮水平:后三组与空白对照组相比,NO2-,NO3-的含量呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著高于空白对照组(21.37±2.21,16.51±1.33,P<0.01)。②一氧化氮合酶活性:后三组与空白对照组相比,一氧化氮合酶呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著强于空白对照组(70.65±15.63,36.62±11.16,P<0.01)。③前列环素水平:后三组与空白对照组相比,6-酮前列腺素F1α含量呈浓度依赖性增加,其中10-7mol/L浓度组显著高于空白对照组(572.69±1.86,563.93±2.66,P<0.01)。结论:尾加压素Ⅱ能刺激人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮及前列环素,提示尾加压素Ⅱ可能通过刺激一氧化氮和前列环素的产生而发挥舒张血管的作用。     

大剂量阿托伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2的影响

目的研究不同剂量阿托伐他汀对培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性的影响。方法用含10%小牛血清的DMEM培养液体外培养大鼠主动脉VSMC,随机分为对照组,不同剂量阿托伐他汀干预组,运用MMP-2活性酶图分析法结合光密度扫描分析,观察不同剂量阿托伐他汀对VSMC的MMP-2表达的影响。结果不同剂量阿托伐他汀组均明显抑制MMP-2的活性,且具有剂量依赖性。结论阿托伐他汀可以显著降低VSMC的MMP-2的表达,大剂量抑制作用更强。     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

阿托伐他汀对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞Toll样受体4及其下游信号转导通路的影响

背景:研究表明Toll样受体4参与了动脉粥样硬化的发生和发展,目前Toll样受体4与MyD88依赖性或MyD88非依赖性信号转导通路在动脉粥样硬化发生和发展中的机制尚不明确.目的:观察阿托伐他汀对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞Toll样受体4及其下游信号转导通路主要元件MyD88、TRAF-6、TRAM及TRIF表达的影响,分析阿托伐他汀防治动脉粥样硬化的机制.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,用脂多糖刺激并加入阿托伐他汀干预24 h,收集细胞,用荧光定量PCR方法测定TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM及TRIF mRNA表达;用Western blotting法测定TLR4、MyD88及TRAF-6蛋白表达.结果与结论:用脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞后,引起TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM和TRIF的高表达(P < 0.01),用阿托伐他汀干预后可显著抑制TLR4、MyD88及TRAF-6的表达(P < 0.01).提示阿托伐他汀可阻断Toll样受体4高表达,同时阻断Toll样受体4胞内信号转导的MyD88依赖性途径,这可能是阿托伐他汀抗动脉粥样硬化的作用机制之一.     

血管紧张素-Ⅱ对血管内皮细胞游离钙离子浓度的影响及阿托伐他汀的保护作用

目的:观察血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)对血管内皮细胞(VEC)游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响及阿托伐他汀的保护作用。方法:将血管内皮细胞分为空白对照组(仅给予细胞培养液)、Ang-Ⅱ组(细胞培养液中加入Ang-Ⅱ,使其终浓度为10-7mol/L)、Ang-Ⅱ+小剂量阿托伐他汀组(在单纯Ang-Ⅱ组的基础上加入阿托伐他汀,使阿托伐他汀的终浓度为0.1μmol/L)、Ang-Ⅱ+大剂量阿托伐他汀组(在单纯Ang-Ⅱ组的基础上加入阿托伐他汀,使阿托伐他汀的终浓度为1μmol/L)。用激光共聚焦显微镜测量各组细胞的[Ca2+]i。结果:(1)Ang-Ⅱ组的[Ca2+]i显著高于空白对照组(P<0.01);(2)Ang-Ⅱ+阿托伐他汀组的[Ca2+]i显著低于Ang-Ⅱ组(P<0.01)。(3)Ang-Ⅱ+大剂量阿托伐他汀组的[Ca2+]i低于Ang-Ⅱ+小剂量阿托伐他汀组(P<0.05)。结论:Ang-Ⅱ可引起细胞内[Ca2+]i的显著增加,阿托伐他汀对Ang-Ⅱ所致的[Ca2+]i增加具有保护作用,且这一作用呈剂量依赖性。     

内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性

目的：应用内部核糖体进入位点构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体，研究外源性基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞ECV304中的转染表达，探讨内皮型一氧化氮合酶与血管结构及功能的相关性。方法：实验于2003-12／2004-12在南京鼓楼医院科研部完成。将Phcmvspla—enos中内皮型一氧化氮合酶基因和PcDNA—vegf中血管内皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体PcDNA—ires中，构建重组质粒PcDNA—enos—ires-lvegf，经酶切，聚合酶链反应扩增和部分DNA测序分析证实后，转染人脐静脉内皮细胞，硝酸还原酶法检测转染后细胞中一氧化氮和一氧化氮合酶活性，免疫组化和荧光双标记及western blotting检测转染后细胞蛋白水平的表达，Trizol提取总RNA，反转录一聚合酶链反应测定转染后细胞mRNA水平的表达。结果：成功构建携带内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子的双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf,双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中获得整合及表达。重组基因PcDNA-enos-ires-vegf组与对照组PcDNA-enos在一氧化氮含量和一氧化氮合成酶活性的表达差异无显著性意义。PcDNA-enos-ires-vegf转染细胞后转染效率为30％-40％。结论：双基因表达载体PcDNA-enos-ires-vegf的成功构建和双基因内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子在人脐静脉内皮细胞基因组中表达为研究内皮型一氧化氮合酶在血管结构与功能上所起上所起的作用奠定了基础。     

羊水干细胞分泌细胞因子及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

背景:关于细胞移植的功效,重点在于其分泌的促增殖或抗凋亡的细胞因子,羊水干细胞能否分泌相关细胞因子有必要深入分析.目的:观察分离培养的羊水于细胞分泌细胞因子情况,及其对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-12/2009-06在南昌大学第一附属医院高血压病研究所完成.材料:10例剖宫产孕妇足月羊水,50 mL/例,用于分离培养羊水干细胞,同时留取其产后脐静脉用于分离培养内皮细胞,取前均获孕妇知情同意.方法:①贴壁法分离培养羊水干细胞,达80%融合时胰酶消化传代,取传至第3代细胞,调整细胞密度为5×10~8L~(-1),分为2组:缺氧羊水干细胞组通入体积分数为2%O_2+体积分数为5%CO_2+体积分数为93%N_2,常规羊水干细胞组通入体积分数为5%CO_2+体积分数为95%空气,两组细胞37℃培养24 h,收集各自培养上清液及细胞以备分析.②取体外分离培养的第2代人脐静脉内皮细胞,以2×10~4细胞/孔的密度接种于12孔板,分为3组:对照组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液2 mL,常规羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+羊水干细胞培养液1 mL,缺氧羊水干细胞组加入含体积分数为5%胎牛血清的EBM-2新鲜培养液1 mL+缺氧诱导羊水干细胞培养液1 mL,培养3d,加入10 μg/L肿瘤坏死因子α诱导细胞凋亡.主要观察指标:流式细胞仪测定羊水干细胞表面抗原表达,ELISA法测定羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子情况,RT-PCR法测定细胞因子mRNA的表达,检测内皮细胞增殖率及凋亡率.结果:培养7 d后羊水干细胞呈长梭形,以漩涡状、辐射状排列,第3代羊水干细胞呈CD29~+,CD105~+,CD34~-.常规培养的羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子;缺氧诱导条件下血管内皮细胞生长因子水平明显增加(P＜0.01),其mRNA表达明显上调(P＜0.05),而肝细胞生长因子含量及mRNA的表达均无明显变化(P＞0.05).与对照组比较,培养3 d后常规羊水干细胞组、缺氧羊水干细胞组内皮细胞数均明显增加(P＜0.05),肿瘤坏死因子α诱导凋亡24 h后内皮细胞凋亡率均明显降低(P＜0.05),且缺氧羊水干细胞组变化幅度大于常规羊水干细胞组(P＜0.05).结论:羊水干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子,羊水干细胞培养液能促进内皮细胞增殖,抑制内皮细胞凋亡.经缺氧处理后,羊水干细胞分泌血管内皮细胞生长因子的能力增加,对内皮细胞的增殖和凋亡干预作用增强.