粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。     

粉尘螨主要变应原基因Der f1和Der f3改组的研究

目的:探索粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3改组条件,以期获得粉尘螨变应原融合突变基因。方法:RT-PCR方法扩增粉尘螨变应原Der f 1和Der f3基因,用DnaseⅠ分别酶解Der f 1和Der f3基因10、15、20、25、30 min;酶解相同时间的Der f1和Der f3基因片段两两混合,采用DNAshuffling技术对粉尘螨变应原Der f1和Der f3基因进行重组,琼脂糖凝胶电泳检测重组子。结果:以Der f 2 F和Der f2 R为引物在酶切10、15、20、25、30min均可扩增出清晰条带;以Der f1 F和Der f1 R、Der f1 F和Der f2 R、Der f2 F和Der f1 R为引物在酶切10、15、20、25、30min的模板中均无条带出现;而其他引物组合则在不同酶切时间的模板中均出现条带。结论:通过多种条件的组合,可获得多个粉尘螨变应原基因Der f1和Der f3间的融合基因,为大规模制备高效、低价的哮喘疫苗奠定了基础。     

粉尘螨Ⅰ类变应原成熟肽段基因的克隆和生物信息学分析

目的了解不同地区粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)成熟肽段基因序列的变异性及其编码蛋白的化学及免疫学特征。方法从皖南地区分离鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR扩增Der fⅠ成熟肽段基因,克隆到T载体测序确认。应用生物信息学软件对该基因进行初步分析。结果获得皖南地区两种不同基因型的Der fⅠ成熟肽段基因,与GenBank公布的其他地区Der fⅠ基因序列比较同源性在98.73%～99.84%之间;相应编码氨基酸序列的同源性在99.04%～100%之间,存在6个氨基酸残基变异位点,并影响其抗原表位的改变。结论不同地区Der fⅠ成熟肽段基因序列及其编码氨基酸序列存在差异,并对其免疫原性产生影响。克隆并分析研究我国各地的尘螨变应原基因序列及氨基酸序列变化,对于临床变应性疾病的诊治有重要的意义。     

粉尘螨第五组主要变应原(Der f5)的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨第五组变应原(Dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 提取活粉尘螨总RNA,扩增Der f5片段.PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a(+)连接,转化人大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果.Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性.结果 构建了重组质粒pMD18-Der f5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符.纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性.结论 获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白.初步鉴定了该蛋白的免疫原性.     

粉尘螨I类变应原成熟肽段基因的克隆和生物信息学分析

目的 了解不同地区粉尘螨Ⅰ类变应原(Der f I)成熟肽段基因序列的变异性及其编码蛋白的化学及免疫学特征.方法 从皖南地区分离鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,采用RT-PCR扩增Der fⅠ成熟肽段基因.克隆到T载体测序确认.应用生物信息学软件对该基因进行初步分析.结果 获得皖南地区两种不同基因型的Der fⅠ成熟肽段基因,与GenBank公布的其他地区Der fⅠ基因序列比较同源性在98.73%-99.84%之间;相应编码氨基酸序列的同源性在99.04%-100%之间,存在6个氨基酸残基变异位点,并影响其抗原表位的改变.结论 不同地区Der fⅠ成熟肽段基因序列及其编码氨基酸序列存在差异,并对其免疫原性产生影响.克隆并分析研究我国各地的尘螨变应原基因序列及氨基酸序列变化,对于临床变应性疾病的诊治有重要的意义.     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析

目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法(Western-blot)分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示:表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示:Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20~35、121~131、340~359及485~500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。 更多还原     

粉尘螨Der fI变应原的免疫化学特征鉴定

作者在原制备Der f Ⅰ变应原基础上进行其免疫化学特征鉴定。Der fⅠ的交叉免疫电泳(CIE)结果证实提纯的Der f Ⅰ为均质性。Der f Ⅰ氨基酸组成与Dandeu(1982)、Heymann(1986)报道的Der f Ⅰ相应结果相关性比较表明,三者在氨基酸组成上有相似性。采用放射性变应原吸附试验(RAST)检测55份螨过敏性患者血清抗Der f ⅠIgE抗体水平,其中49.09％病人RAST阳性,平均阳性特异性IgE水平为6.58±3.90百分结合率。结果表明Der f Ⅰ是粉尘螨主要的变应原。     

室内空调机滤尘网尘螨、腐食酪螨变应原基因的检测

目的:检测室内空调机滤尘网中粉尘螨1类变应原(Dermatophagoides farinae 1,Der f 1)、屋尘螨1类变应原(Dermatophagoides pteronyssinus 1,Der p 1)和腐食酪螨1类变应原(Tyrophagus putrescentiae 1,Tyr p 1).方法:分...     

豚草花粉过敏原的分析、鉴定与纯化

目的：对豚草花粉变应原蛋白进行分析、鉴定与纯化。 方法：提取豚草花粉粗提液,SDS-PAGE分离其蛋白组份并测定分子量,Western-blotting鉴定其变应原组份,通过离子交换层析对花粉变应原进行初步纯化和免疫印迹鉴定。 结果：豚草花粉有30条蛋白带,其中主要条带有9条,70kDa、40kDa为其特异性变应原。经离子交换层析纯化出豚草花粉相对分子量为40 kDa的变应原主要分布在Ⅰ峰。 结论：豚草花粉粗提液中主要变应原为 70 kDa、40kDa蛋白组份。     

粉尘螨Ⅱ类抗原(Der f 2)的cDNA克隆测序及亚克隆

目的 :获得粉尘螨Derf 2cDNA克隆及亚克隆 ,并进行测序。方法 :设计合成引物 ,从粉尘螨螨体中提取RNA ,经RT PCR获得cDNA ,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至 pMD 18T ,转化大肠杆菌E .coliJM 10 9,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序 ,将PCR筛检阳性重组子及 pET 3 2a( +)表达载体分别用SacⅠ和NotⅠ双酶切 ,连接转化至E .coliCompetentCellJM 10 9中过夜培养 ,挑选菌落进行酶切鉴定。结果 :从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf 2cDNA片段 ,成功构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚克隆 ,酶切产物的大小与预期相符。结论 :成功地对粉尘螨Derf 2cDNA进行体外扩增并构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚 克隆     

尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mI...     

Allergen micro-array detection of specific IgE-reactivity in Chinese allergy patients

Background  Allergen micro-arrays are powerful tools for screening of serum IgE-reactivity. In this study allergen micro-arrays were used to identify dominating IgE-binding allergens and cross-reactivity patterns among selected Chinese allergy patients.

Methods  The study was conducted using patient sera from the cities of Guangzhou, Nanjing, Chengdu and Shenyang. In total 100 sera with Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) specific IgE-levels higher than 50 kU/L were selected for testing against 103 individual allergens.

Results  Among 100 selected patients, 95% showed IgE-reactivity towards house-dust mite allergens Dermatophagoides farinae (Der f) 1, Der f 2 and Der p 2 and 94% were IgE positive against Der p 1, and 60% of sera contained IgE reacting against allergen Euroglyphus maynei (Eur m) 2. IgE against cat allergen, Felisdomesticus (Fel d) 1, was seen in 20%. Only 2% showed specific IgE-reactivity to Der p 10, a panallergen belonging to the tropomyosin family. Serum IgE-reactivity towards other allergens was in general low. IgE-reactivity against pollen allergens showed geographic differences.

Conclusions  This study clearly confirms that group 1 and group 2 are major allergens of house dust mites. These selected house-dust mite allergy patients are close to being mono-sensitized. Der p 10 is not an important allergen for cross-reactivity. Specific IgE-sensitization towards pollen allergens is low in southern China compared to other regions. The prevalence of food and stinging insect allergens known to give rise to IgE-mediated cross-reactivity is 2% or less.

     

中国龙虾过敏原的分离纯化研究

目的:分离、纯化和鉴定中国龙虾的主要过敏原。方法:利用传统的硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀方法对过敏原粗提夜进行初分,在蛋白核酸检测仪检测控制下,用DEAE-52离子交换层析柱进行阶段洗脱和Sepha-dex G-100凝胶柱层析,免疫斑点法(Dot-ELISA)确定其免疫活性部分。结果:中国龙虾过敏原蛋白的硫酸铵沉淀范围在35%～60%之间,pH=4.7、4.5时的等电点沉淀蛋白质有明显的过敏原活性;离子交换层析中的具过敏原活性蛋白峰的蛋白条带分子量为15 000、20 700、34 000、60 000和83 200;Sephadex G-100凝胶层析后具过敏原活性蛋白峰SDS-PAGE显示只有34 000分子量的蛋白条带,纯度为91.5%。结论:分离、纯化鉴定出中国龙虾分子量为34 000的主要过敏原,对于过敏原的标准化、提高过敏性疾病诊治水平具有重要的意义。     

重组Der f1变应原诱导小鼠哮喘模型的建立

目的建立重组粉尘螨Ⅰ类变应原（Der f1）诱导BALB/c小鼠哮喘模型。方法 30只BALB/c小鼠随机分成3组：PBS阴性对照组、卵清蛋白（OVA）阳性对照组、重组Der f1模型组。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IgG1、IgG2α和IgE含量,ELISA法检测脾细胞培养上清液和支气管肺泡灌洗液（BALF）IL-2、IL-4、IL-5、IL-17和IFN-γ含量,计数BALF中细胞总数,同时切取小鼠未灌洗侧肺组织进行病理学观察。结果 OVA阳性对照组、重组Der f1模型组小鼠血清中IgG1、IgG2a和IgE含量,脾细胞上清液和BALF中IL-2、IL-4、IL-5、IL-17和IFN-γ含量与PBS阴性对照组相比差异均具有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）;OVA阳性对照组、重组Der f1模型组小鼠BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞（EOS）计数显著高于PBS组（P〈0.05或P〈0.01）。OVA阳性对照组和重组Der f1模型组小鼠肺部病理改变呈明显的变态反应性炎症。结论用重组Der f1能成功诱导BALB/c小鼠哮喘模型。     

屋尘螨第13组变应原克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达及纯化屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus,Der p)第13组变应原(Der p13)蛋白,并鉴定其免疫原性.方法 提取屋尘螨总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得Der p13的cDNA片段.正确设计引物,利用已获得的cDNA片段进行PCR扩增,获得...     

悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析

目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析。方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析，收集主要蛋白质，SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量，并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清。结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰，第一峰及第二峰升段富含蛋白，而第二峰降段蛋白含量甚微，收集各段进行SDS—PAGE。出现6条蛋白区带，分子量分别为7、50、35、39、22和16kd。第一峰主要含22-71kd蛋白质，峰2升段以14-16kd之蛋白质为主。对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带，蛋白分子量为50、39、22和16kd，病人血清结合百分比分别为100％、28．57％、57．14％和14．29％。结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分，第一峰的50、39和22kd的蛋白质为主要致敏组分，第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原。     

居室粉螨抗原与螨过敏性哮喘相关性研究

目的:检测张家港市部分居室粉螨抗原及浓度,探讨其与螨过敏性哮喘发作的相关性。方法:收集过敏性哮喘患者及健康者居室床面、地面、家具、空调隔尘网及空气中的灰尘样本,用PCR法检测Der f1、Der f2、Der p1、Der p2阳性率,并用ELISA分别定量检测Der f1、Der p1及Der变应原含量。结果:共收集样本400份,过敏性哮喘患者与健康者居室Der f1、Der f2、Der p1、Der p2基因阳性率无显著性差异(P>0.05),但过敏性哮喘患者居室样本中这些变应原浓度>10μg/g者所占比例显著少于健康者(P<0.05)。对过敏性哮喘患者进行问卷调查结果显示,近期哮喘发作者Der f1、Der f2、Der p1、Der p2浓度>2μg/g所占比例明显高于近期哮喘未发作者(P<0.01)。结论:个体特异性是螨过敏性哮喘患者患病的重要因素,居室粉螨抗原浓度<2μg/g较安全。     

屋尘螨第21类过敏原原核表达和过敏原性鉴定

目的 屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法 提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果 双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD, Western blotting结果显示有明显条带。结论 成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。