食管癌细胞Ezrin基因转录调控区克隆及其启动子活性的鉴定

目的:克隆食管癌侵袭转移相关基因Ezrin的转录调控区序列,进行启动子活性鉴定及初步的生物信息学分析。方法:利用在线程序对Ezrin基因可能的转录调控区进行GC含量和CpG岛分析以及转录因子结合位点预测;采用PCR法从食管癌细胞基因组DNA中克隆Ezrin基因-1759/ 134和-726/ 134区段,构建萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒pGLB-hE(-1759/ 134)和pGLB-hE(-726/ 134),检测所克隆片段的启动子活性。结果:Ezrin基因5′侧翼区为高GC含量区,存在CpG岛,无典型的TATA盒,然而转录因子Sp1结合位点却无处不在。与对照质粒pGLB相比,重组质粒pGLB-hE(-726/ 134)具有较强的荧光素酶活性,pGLB-hE(-1759/ 134)的荧光素酶活性约是pGLB-hE(-726/ 134)的2倍。结论:Ezrin基因的-726/ 134区段具有启动子活性,含有Ezrin基因的核心启动子区和调节性启动子区;-1759/-726区段具有增强启动子活性的作用,含有Ezrin基因增强子元件区。     

siRNA干扰ERK1/2表达对食管癌细胞 ezrin 基因的转录调控作用

 目的：检测siRNA干扰细胞外信号调节激酶ERK1/2基因表达对 ezrin 基因的转录调控作用,探讨食管癌细胞 ezrin 基因的表达调控机制。 方法：采用定量RT-PCR技术,检测转染ERK1/2 siRNA对食管癌EC109细胞ERK1/2和 ezrin 基因 mRNA表达水平的影响;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测siRNA干扰ERK1/2表达对EC109 细胞 ezrin 基因启动子活性的影响。 结果：在食管癌EC109细胞中,转染ERK1/2 siRNA,降低ERK1/2和 ezrin 基因的mRNA表达水平以及 ezrin 基因启动子活性。 结论：ERK1/2对食管癌细胞 ezrin 基因的转录具有调控作用。     

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

 目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。     

ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列转录活性的鉴定

目的检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5′侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/ 134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/ 134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/ 134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力。结果ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5′侧翼区-1444/ 134序列具有较强的转录活力。结论ezrin基因5′侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用。     

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

 目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。 方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69, 相对于转录起始位点)和AP 1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。 结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP 1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50％左右;同时置换Sp1结合位点和AP 1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。 结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP 1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。     

食管癌细胞NGAL 基因-416～+84 区段存在TPA 反应元件

 目的 本文旨在对NGAL基因启动子区及其附近是否存在TPA反应元件进行研究。方法 （1）采用PCR法从食管癌细胞中克隆NGAL基因5’侧翼区-416-＋84片段，然后分别插入质粒pGLB和pGLE，构建pGLB-416和pGLE-416荧光素酶报告基因表达栽体；（2）将pGLB-416和pGLE-416分别同pRL—TK共转染食管癌细胞EC109；（3）用TPA刺激转染的EC109，检测细胞相对荧光素酶活力，通过相对荧光素酶活力变化判定NGAL基因5’侧翼-416～＋84区是否存在TPA反应元件，同时进行生物信息学分析。结果 无论是pGLB-416还是pGLE-416，与pRL-TK共转染食管癌细胞EC109后，用TPA刺激，与其相应的空载体相比，转染细胞荧光素酶活力均极显著升高（t检验，P〈0．01），约分别升高46．82和46．41倍；而TPA刺激组与没有TPA刺激组相比，pGLB-416和pGLE-416转染EC109细胞荧光素酶活力分别显著升高了5．17倍和7．37倍（t检验，P〈0．01）。生物信息学分析显示，NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段至少存在4个潜在的TPA反应元件。结论 食管癌细胞NGAL基因5’侧翼-416～＋84区段存在着TPA反应元件。     

MLAA-22基因上游调控区的分离及启动子活性分析

目的:分离MLAA-22 基因上游转录调控区序列,进行启动子活性鉴定。方法:人工合成MLAA-22 基因上游转录调控区序列MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1)两个区段,将两个区段插入到双荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK-2的BglⅡ/NheI限制性内切酶位点中,构建双荧光素酶报告基因表达质粒,将重组质粒分别命名为psiCHECK-2-MLAA-22（-999～+1)和psiCHECK-2-MLAA-22（-1999～+1）;采用双荧光素酶报告基因系统检测所分离区段的启动子活性。结果:MLAA-22（-999～+1)和MLAA-22（-1999～+1）两个区段均具有较强的相对荧光素酶活性,并且MLAA-22（-999～+1)区段的相对荧光素酶活性明显高于MLAA-22（-1999～+1）区段。结论:MLAA-22 基因上游转录调控区（-999～+1）区段将是今后我们进行MLAA-22 基因上游转录调控区启动子活性研究的重点区域。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5’端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的：从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因5’端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法：采用PCR法克隆NGAL基因5’端转录调控区，并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果：从SHEEC中获得了NGAL基因5’端转录调控区-1124— 65区段的克隆，该区段序列有3处点突变，在NGAL基因-1124— 65区段共鉴定出78个有效顺式作用元件位点。结论：多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素。     

人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定

[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

食管癌细胞SHEEC中NGAL基因5′端转录调控区的克隆及其顺式作用元件定位分析

目的 :从食管癌细胞SHEEC中克隆NGAL基因 5′端转录调控区并进行顺式作用元件定位分析。方法 :采用PCR法克隆NGAL基因 5′端转录调控区 ,并通过NCBI公共数据库BLAST序列分析鉴定突变。应用KEGG序列数据库对该调控区进行顺式作用元件定位分析。结果 :从SHEEC中获得了NGAL基因 5′端转录调控区 - 112 4～ +6 5区段的克隆 ,该区段序列有 3处点突变 ,在NGAL基因- 112 4～ +6 5区段共鉴定出 78个有效顺式作用元件位点。结论 :多种反式作用因子可能是永生化食管上皮细胞恶性转化中NGAL基因转录增强的重要调控因素     

食管鳞状细胞癌中MGMT和p16基因启动子甲基化关系分析

背景与目的:探讨食管鳞状细胞癌中06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)基因和p16基因启动子的甲基化情况,了解这两个基因启动子甲基化与食管癌发生的关系. 材料与方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)方法分别对44例食管鳞状细胞癌组织进行MGMT基因和p16基因的甲基化检测,并对其甲基化频率分别进行差异性检验和关联性分析.结果:在44例食管鳞癌组织中,有18例(40.9%)出现MGMT基因启动子甲基化,23例(52.3%)出现p16基因启动子甲基化,7例(14.9%)两基因均出现甲基化,10例(22.7%)两基因均未出现甲基化.MGMT和p16基因启动子甲基化率差异无统计学意义(P＞0.05).MGMT和p16基因启动子甲基化无明显相关关系(P＞0.05).结论:MGMT和p16基因启动子甲基化均可能与食管鳞状细胞癌发生、发展过程密切相关,但二者是相互独立进行的.     

食管鳞癌形成中基因表达谱的研究

[目的]初步了解食管鳞癌形成中5个不同时期（正常、食管上皮不典型增生Ⅰ级、食管上皮不典型增生Ⅱ级、食管原位鳞癌和食管鳞癌）的基因表达谱,并探讨cDNA微点阵技术在肿瘤研究中的应用价值。[方法]收集上述5种不同病理类型的组织标本,提取总RNA,逆转录合成cDNA探针,分别与cDNA微点阵膜杂交,随机挑选8个EST片段,分别以杂交样品和配对组织标本总教育界模板完成RT-PCR以验证杂交结果的准确性,用专用软件分析得到各位点光密度值,将此数值标准化后进一步比较分析。[结果]对于杂交样品和配对组织标本,都是6个EST片段的RT-PCR结果与其杂交结果一致,数据分析显示,正常时期和其他各期相比分别有492,481,473和501个基因的表达改变了2倍及2倍以上,其中386个基因在4个异常时期均表达下调,而其他各期之间相比,大多数基因的表达无明显改变,还观察了一些已知的肿瘤相关基因在5个不同时期的表达状况。[结论]本实验再一次证实食管上皮不典型增生Ⅰ级是食管鳞癌形成的一个早期阶段。利用cDNA微点阵技术将有望发现导致食管鳞癌形成的关键基因,为临床早期诊断、治疗和预防提供新的线索。     

体外培养的食管癌细胞光动力疗法的电镜观察

背景与目的： 研究光动力疗法对食管癌细胞超微结构的影响。 材料与方法： 培养的食管癌细胞分别与光敏剂作用6、12和24 h后,再经紫外线(Ultraviolet B,UVB)照射0.5 h。 通过透射电镜观察各实验组和对照组食管癌细胞的超微结构。 结果： 电镜下可见实验组食管癌细胞出现线粒体固缩,粗面内质网减少,滑面内质网扩张,核膜断裂,核仁固缩。上述膜性结构的损伤随着光敏剂作用时间延长而加重。 结论： 光动力疗法可导致食管癌细胞超微结构,尤其是膜性结构损伤,因而可能具有治疗食管肿瘤的效应。     

食管鳞癌中DACT2基因表达及甲基化状态研究

[目的]检测食管鳞状细胞癌(ESCC)中DACT2基因表达及启动子区甲基化状态,探讨DACT2基因在食管鳞癌发生发展中的作用.[方法]分别应用逆转录—聚合酶链反应(RTPCR)以及甲基化特异性PCR(MSP)的方法检测DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)处理前后的食管癌细胞系(TE1、TE13、T.Tn、Eca109)以及食管鳞癌组织及相应癌旁组织中DACT2 mRNA表达情况及启动子区甲基化状态.[结果]经5-aza-dC处理后4种食管癌细胞系中DACT2基因的表达均增高.4种未经5-aza-dC处理的食管癌细胞系中DACT2基因呈高甲基化状态.应用5-aza-dC处理后,DACT2基因在4种细胞系中均呈非甲基化状态.DACT2基因在食管鳞癌组织中的表达显著低于癌旁组织(0.66±0.53 vs 0.95±0.64,t=-2.43,P=0.018),并与淋巴结转移密切相关(t=-2.030,P=0.048).食管鳞癌组织中DACT2基因的启动子区甲基化率显著高于癌旁组织(50.0％ vs 21.1％,x2=9.439,P=0.002),并与TNM分期、组织学分化程度和淋巴结转移密切相关(P均＜0.05).发生DACT2基因甲基化的食管鳞癌组织中DACT2基因的表达量显著低于未发生甲基化的食管鳞癌组织(0.46±0.32 vs 0.78±0.61,t=-2.341,P=0.023).[结论]DA CT2基因在食管鳞癌中的异常低表达与食管鳞癌的发生、发展密切相关,且其启动子区甲基化可能是导致其表达沉默的机制之一.     

食管鳞癌中PTEN蛋白的表达及意义

目的　通过对PTEN在食管鳞癌中表达的研究,探讨其与食管鳞癌的发生、浸润、转移的关系。方法　应用免疫组织化学S P法检测49例食管鳞癌组织及40例正常食管黏膜组织中PTEN的表达。结果　食管鳞癌组织中PTEN蛋白表达率为5 3 0 6% (2 6/4 9)。显著低于正常食管黏膜组织的表达10 0 % (4 0 /4 0 ) ,在不同分化程度的癌组织中其阳性表达率有显著性差异(P <0 0 5 ) ,且PTEN蛋白表达率随癌组织浸润深度的加深而明显降低(P <0 0 5 ) ,有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组(P <0 0 5 )。结论　PTEN基因缺失或蛋白表达降低在食管鳞癌的发生发展中可能起重要作用,且与肿瘤的分化程度、浸润转移密切相关。