血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的:观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用,为临床治疗提供实验依据。方法:实验于2003-10/2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体,经过7d选择性培养得到神经干细胞,利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况;将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养,通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度;在外源性血管内皮生长因子存在的情况下,利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体,观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果:经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞(95±3)%以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2,该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后,发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论:实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞,血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

血管内皮祖细胞鉴定及其促血管新生机制的研究进展

血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)既往被认为在出生后血管新生中发挥主要作用。1997年Asahara等从外周血分离出表达CD34抗原的单个核细胞,即血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)。EPCs是一类具有促血管生成能力的干细胞总称,尚未发现特异性免疫表型,故主要根据具有形成血管的功能鉴定。目前一般认为,EPCs来源于骨髓和外周血管壁,其中能分化为ECs者被称为内皮集落形成细胞(endothelial colony forming cells,ECFCs)。当组织缺血或损伤时,来自骨髓的EPCs被组织释放的损伤信号动员后进行迁移和归巢。活化的EPCs通过旁分泌作用招募更多的局部ECFCs和ECs来形成微血管,进而促进组织修复。因此,对EPCs的深入研究有助于临床上治疗性血管新生相关研究的进行和方法的发展。     

自体内皮前体细胞移植促缺血心肌血管新生的实验研究

目的研究从外周血中获取的内皮前体细胞自体移植后促进心肌缺血区域血管新生的可行性和有效性,欲为冠心病患者的治疗提供新的细胞移植学方法。方法抽取动物的外周动脉血,应用密度梯度离心法获取单个核细胞。应用加入VEGF和bFGF的特定培养基培养后,获得CD31、CD34、Flk-1和vWF免疫荧光染色阳性的内皮前体细胞;结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;然后将得到的自体细胞重新植入缺血心肌局部区域。对照组注入细胞培养液。结果移植组与对照组比较,HE染色显示心肌胶原纤维融合较少,组织排列结构更为有序;移植区域微血管密度明显增高。结论通过一定的体外分离、定向分化、培养、扩增途径,可以从外周血获得较为纯化的内皮前体细胞;内皮前体细胞移植对局部梗死心肌组织结构有一定的保护作用,并可促进血管新生。     

血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠:高压氧干预促进治疗性血管生成

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后梗死区周边心肌的缺血、缺氧、炎性反应、细胞凋亡等病理变化严重影响到移植骨髓间充质干细胞的存活,而高压氧能显著改善其缺氧状态。目的:对心肌梗死模型大鼠缺血心肌局部移植血管内皮生长因子修饰的骨髓间充质干细胞,在移植后对大鼠进行高压氧干预,探讨其对骨髓间充质干细胞移植后所获得的治疗性血管生成效应的影响。方法:将真核表达载体pcDNA3.1(-)/人血管内皮生长因子165转染大鼠骨髓间充质干细胞,再移植至心肌梗死模型大鼠的缺血区组织,移植前细胞行CM-DiI标记。移植后2周每日对大鼠行高压氧治疗干预。移植1个月后行心脏B超测量其左室射血分数,组织化学苏木精-伊红染色和Ⅷ因子染色并评价新生血管密度。结果与结论:CM-DiI能有效标记骨髓间充质干细胞,标记率近100%。细胞移植1个月后高压氧干预的大鼠射血分数、再生血管密度较均明显增高(P<0.05)。证实,高压氧干预能显著促进移植血管内皮生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的心肌梗死大鼠所获得的治疗性血管生成作用,对心脏功能有明显改善作用。     

血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源神经干细胞增殖的促进

目的：观察血管内皮生长因子对胚胎干细胞来源的神经干细胞增殖的促进作用，为临床治疗提供实验依据。方法：实验于2003-10／2005-05在北京大学医学部干细胞研究中心完成。小鼠胚胎干细胞在不含有白细胞抑制因子的条件下形成类胚体，经过7d选择性培养得到神经干细胞，利用免疫荧光的方法检测神经干细胞标志物nestin以及sox-2的表达情况；将神经干细胞与血管内皮生长因子共培养，通过氚标记的胸腺嘧啶核苷掺入的方法测定细胞的增殖速度；在外源性血管内皮生长因子存在的情况下．利用受体2中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体，观察外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结果：经鉴定胚胎干细胞来源的神经干细胞（95&;#177;3）％以上表达神经干细胞标志物nestin以及sox-2，该细胞在体外可以传代。与血管内皮生长因子共培养后，发现随着血管内皮生长因子浓度的升高神经干细胞增殖速度明显加快。通过中和抗体或者血管内皮生长因子受体2特异性抑制剂阻断血管内皮生长因子受体2可以阻断外源性血管内皮生长因子对神经干细胞的增殖作用。结论：实验中诱导小鼠胚胎干细胞得到了高纯度的神经干细胞，血管内皮生长因子能够通过血管内皮生长因子受体2促进神经干细胞增殖。     

自体内皮前体细胞移植促缺血心肌血管新生的实验

背景:循环中内皮前体细胞在一定的条件下可向内皮细胞转化,而且可进一步形成血管。目的:探讨从外周血中获取的内皮前体细胞自体移植后促进心肌缺血区域血管新生的可行性和有效性,为冠状动脉硬化性心脏病患者的治疗提供新的细胞移植学方法。设计:完全随机对照实验。单位:青岛儿童医院心脏中心。材料:选用雄性SD大鼠60只,清洁级,体质量(340±20)g,由青岛实验动物中心提供。实验动物随机分为两组:实验组和对照组,每组30只。两组又按内皮前体细胞注入后2,4,8周3个时间点进行观察,每个时间点10只。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。方法:实验于2003-05/2004-09在青岛医药生物科技重点实验室完成。将实验组动物麻醉后,抽取动物的外周动脉血,应用密度梯度离心法获取单个核细胞。应用加入血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的特定培养基培养后,获得CD31、CD34、FIk-1和血管性血友病因子免疫荧光染色阳性的内皮前体细胞。结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死动物模型,然后将得到的自体细胞重新植入缺血心肌局部区域。对照组注入细胞培养液,其余步骤与实验组相同。分别于结扎后2,4,8周过量麻醉处死所有动物,制作心脏组织切片。主要观察指标:①进行HE染色后光镜下观察心肌基本结构变化情况。②组织切片经Ⅷ因子免疫组化染色后,应用德国ZEISS(蔡司) Axiotron图像分析仪分析视野内Ⅷ因子阳性内皮细胞数量和微血管密度。结果:纳入的60只SD大鼠全部进入结果分析。①对照组心肌组织结构较为杂乱,心肌细胞多为被胶原组织和成纤维细胞所替代,梗死边缘区心肌细胞呈现不规则形状,部分细胞明显肥大。与对照组比较,移植组心肌胶原纤维融合较少,组织排列结构更为有序;移植区域微血管密度明显增高。②内皮前体细胞注入后第2,4和8周组心肌缺血区域微血管密度明显高于对照组的相应时间点,差异有显著性意义(P<0.01)。实验组缺血区域微血管密度随时间推移呈增长趋势,差异有显著性意义(P<0.05)。但是对照组组内比较,差异无显著性意义(P>0.05)。结论:通过一定的体外分离、定向分化、培养、扩增途径,可以从外周血获得较为纯化的内皮前体细胞;内皮前体细胞移植对局部梗死心肌组织结构有一定的保护作用,并可促进血管新生。     

糖尿病对内皮祖细胞移植促血管新生作用的影响

背景：内皮祖细胞为血管新生的前体细胞,通过促血管新生作用治疗糖尿病血管病变有着良好的前景。目的：探讨糖尿病对内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病过程中促血管新生作用的影响。方法：制备糖尿病大鼠模型,提取糖尿病和正常大鼠供体骨髓单个核细胞体外定向培养为内皮祖细胞。同时建立糖尿病及正常大鼠下肢缺血模型,并于缺血病变部位局部移植糖尿病或正常大鼠内皮祖细胞或PBS进行对照。移植后定期应用ELISA方法检测病变部位血管内皮生长因子含量,应用免疫组化方法计数病变部位微血管密度。结果与结论：①受体相同,移植物不同时：移植糖尿病大鼠来源或正常大鼠来源内皮组细胞后,下肢缺血组织中血管内皮生长因子水平及微血管密度比较,差异无显著性意义（P〉0．05）。②移植物相同,受体不同时：正常大鼠移植内皮祖细胞后下肢缺血组织中血管内皮细胞生长因子含量和微血管密度均高于糖尿病组。说明在体外定向培养和病变部位局部注射条件下,糖尿病对骨髓来源内皮祖细胞移植促血管新生作用无明显影响,而对血管新生所处的病变部位微环境有明显影响。     

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的:以内皮前体细胞为对照,探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性。方法:①实验于2003-10/2004-02在解放军总医院心内科实验室完成。选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只。②抽取兔髂骨骨髓,Percoll密度梯度离心后取单个核细胞,采用贴壁法以内皮细胞专用培养基(添加体积分数0.2胎牛血清,内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子,氢化可的松,血管内皮生长因子,表皮生长因子,胰岛素样生长因子1,抗坏血酸,庆大霉素等)培养扩增内皮前体细胞。③取兔腹部皮下脂肪组织,胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞,Iscove改良的Dulbecco培养基培养扩增,将第2代脂肪干细胞传代后,分为2份,分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周,观察细胞的变化。用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定,观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞。结果:①原代内皮前体细胞接种后48h才能贴壁,生长非常缓慢,呈集落状生长,一般需要10d左右才能形成较大的集落,达到传代的目的,传代细胞生长迅速。内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长。②脂肪干细胞培养无需刺激因子,原代细胞接种12h后即开始贴壁,继而迅速进入对数生长期,无集落形成,原代和传代细胞均生长迅速。将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后,细胞形态未见明显变化,但与内皮前体细胞一样,大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白,Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性;培养3周后细胞的贴壁习性改变,几乎所用细胞均为阳性,而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性。③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高,培养后能保持旺盛的分裂能力;老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少,有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞,而且培养时细胞容易老化,表现为细胞体积增大,形态呈扁平状或不规则,细胞浆增多而核变小。壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别。结论:①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单,它不需要多种细胞因子刺激即可生长。②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞。③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞,其体外增长和分化能力受年龄影响较小,而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大。     

内皮前体细胞自体移植促进缺血心肌血管的新生

目的:观察内皮前体细胞自体移植后能否促进血管新生、改善心肌灌注、进而改善心脏功能。方法:实验于2004-01/05在解放军总医院心内科实验室完成。①实验分组:雄性新西兰白兔32只,体质量3.0～3.5kg,随机分为治疗组和对照组,每组16只。②实验方法:治疗组自骨髓获取内皮前体细胞培养扩增。结扎动物冠状动脉前降支根部。心电图检测至少5个胸前导联出现ST段显著抬高作为模型制作成功标志。2.5g/L胰蛋白酶消化细胞,洗涤干净后5mL磷酸盐缓冲液悬浮细胞,结扎前降支2h后将细胞悬液从耳静脉注入动物体内,移植细胞数量为(9.8±2.9)×106个/只。对照组注射磷酸盐缓冲液5mL。饲养5周。③实验评估:分别行超声心动图检查和左心室压力曲线检测心脏功能和心肌组织的梗死情况以及通过免疫组织化学检测观察血管密度。结果:纳入新西兰白兔共32只,因前降支细小排除2只。对照组因心功能衰竭和腹泻各死亡1只。治疗组结扎前降支后突发室性心律失常死亡1只。最终27只进入实验。①体外培养的内皮前体细胞生长迅速,能够在2～3周达到预定移植细胞数量。②内皮前体细胞移植5周后,超声心动图检测显示治疗组动物心肌功能指数显著降低(P<0.01),左心室射血分数显著高于对照组(P<0.01),左心室舒张末压明显低于对照组(P<0.05),而等容收缩期左室压力最大上升速率显著升高(P<0.05)。③治疗组心肌梗死面积显著减小(P<0.01),而血管密度明显高于对照组(P<0.01)。④标记细胞主要位于梗死心肌组织,大部分整合至毛细血管中,参与血管新生。结论:内皮前体细胞自体移植能促进缺血心肌血管新生,有效改善缺血心肌的灌注,进而改善心脏功能。     

血管内皮细胞生长因子及其受体KDR/flk-1对造血起重要调节作用(英文)

现在普遍认为造血细胞和内皮细胞来源于同一群前体细胞 ,即成血管细胞 (hemangioblast) ,但是这群前体细胞至今还没有得到证实。血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及其受体KDR/flk 1是内皮细胞增殖和血管形成的主要调节因子。最近一些实验结果表明 ,VEGF及其受体KDR/flk 1在胚胎和出生后造血中起重要调节作用 ,但确切的作用和机制还不清楚。一些最近发展起来的细胞和分子生物学技术将有利于证实成血管细胞的存在 ,有利于探讨成血管细胞的生物学性质和VEGF及其受体KDR/flk 1对成血管细胞生物学性质的调节作用     

异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡及血管内皮生长因子的表达

背景:目前在临床多采用自体骨髓干细胞及自体外周血干细胞治疗糖尿病足溃疡,少见利用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病足溃疡的基础研究.目的:观察局部移植异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡的效果及血管内皮生长因子的全身及局部表达情况.方法:取雄性Wistar大鼠90只,随机数字表法分为3组:对照组(正常足部溃疡)、干细胞治疗组、糖尿病对照组.干细胞治疗组、糖尿病对照组建立2型糖尿病足溃疡模型,造模后分别注射同种异体骨髓间充质干细胞、干细胞培养基DMEM.造模后第1,4,8天观察各组大鼠溃疡面积、细胞核染色示踪及病理学检查,ELISA法测外周血血管内皮生长因子浓度、Western-blotting法测局部血管内皮生长因子浓度.结果与结论:与糖尿病对照组比较,干细胞治疗组溃疡愈合速度迅速,但仍较对照组愈合缓慢,外周血中血管内皮生长因子表达增高,也未达到正常水平.异体干骨髓间充质干细胞治疗前期(1～4 d)能明显提高局部血管内皮生长因子浓度,但在后期(8 d)局部浓度提高不足.干细胞治疗组愈合缓慢,表皮覆盖不完全,但较糖尿病对照组愈合明显提前,表皮覆盖较明显;细胞核染色示移植后干细胞均聚集于溃疡区周围.提示异体移植骨髓间充质干细胞可促进大鼠糖尿病足溃疡的愈合,其促进愈合的可能机制为其上调了血管内皮生长因子在全身尤其局部的表达.     

BMSCs移植后脊髓损伤大鼠VEGF表达的变化

目的观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白表达的影响。方法以贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质千细胞。压迫法制作大鼠脊髓压迫损伤模型。假手术组仅咬除T8-10棘突和椎板,不损伤脊髓。模型制作后DMEM组、骨髓间充质干细胞组分别进行DMEM与骨髓间充质干细胞损伤区周围局部4点注射。结果假手术组脊髓组织中仅见微量血管内皮生长因子表达。骨髓间充质干细胞组在细胞移植后1,3,5 d,血管内皮生长因子mRNA表达趋势与DMEM组相同,但表达水平均明显高于相应时间点的DMEM(P0.05),移植后7,14 d血管内皮生长因子表达仍明显高于DMEM组(P0.01)。结论骨髓间充质干细胞移植增加了脊髓损伤后血管内皮生长因子基因和蛋白的表达,并延长其表达时间。     

人血管内皮生长因子165基因转染对C17.2神经干细胞体外增殖分化的影响

目的:构建含有人血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒载体,并观察其对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响.方法:将血管内皮生长因子165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV血管内皮生长因子165,转染体外培养的C17.2神经干细胞.以单纯携带绿色荧光蛋白腺病毒转染为对照1组.通过酶联免疫吸附测定检测其在C17.2神经干细胞中不同时间段的表达.C17.2神经干细胞培养24 h后,将pAdCMV GFP和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞(pAdCMV绿色荧光蛋白和pAdCMV血管内皮生长因子165转染组),24,48,72 h后每孔加入四氮唑盐10μL,检测pAdCMV转染对C17.2神经干细胞增殖的影响.将未进行pAdCMV绿色荧光蛋白,pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞设为对照2组.收集C17.2神经干细胞(C17.2神经干细胞组)和已经转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞(pAdCMV血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞组),对两组细胞进行培养,将上述细胞爬片进行多聚甲醛固定,行巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶免疫组化法检测.结果:①重组腺病毒AdCMV血管内皮生长因子165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/L.酶联免疫吸附检测转染pAd血管内皮生长因子165的C17.2神经干细胞上清VEGF浓度显示转染后第3天为(710±82)ng/L,明显高于转染前(118±20)ng/L,第5天和第7天血管内皮生长因子165达分泌高峰,分别为(1110±126),(1135±138)ng/L,此后渐下降,于第13天(355±35)ng/L仍显著高于对照1组(¨0±22)ng/L和转染前(t=5.87,P＜0.01).②C17.2神经干细胞培养24,48,72 h后对照2组干细胞增殖率分别为(0.1367 ±0.018 6)%,(0.330 0±0.013 4)%,(0.660 3±0.020 7)%,pAdCMV绿色荧光蛋白转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.139 9±0.018 3)%,(0.373 0±0.013 6)%,(0.671 3±0.233)%;pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞24,48,72 h后干细胞的增殖率分别为(0.146 9±0.0171)%,(0.363 1 ±0.013 6)%,(0.635 3±0.024 7)%.两个实验组神经干细胞增殖率与对照组1组比较,P＞0.05.pAdCMV血管内皮生长因子165转染组C17.2神经干细胞增殖率与pAdCMV绿色荧光蛋白转染组比较,P＞0.05).③C17.2神经干细胞组和pAdCMV血管内皮生长因子165转染C17.2神经干细胞组的巢蛋白阳性细胞率分别为(15.72±1.003)%,(17.63±1.082)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率分别为(17.63±1.082)%,(21.49±1.022)%,两组比较无明显差异(P＞0.05).结论:成功构建pAdCMV血管内皮生长因子165重组腺病毒,获得了稳定表达血管内皮生长因子165的神经干细胞克隆,体外pAdCMV血管内皮生长因子165未对C17.2神经干细胞增殖和分化产生影响.     

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的：以内皮前体细胞为对照，探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性。方法：①实验于2003-10／2004-02在解放军总医院心内科实验室完成。选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只。②抽取兔髂骨骨髓，Percoll密度梯度离心后取单个核细胞，采用贴壁法以内皮细胞专用培养基（添加体积分数0．2胎牛血清，内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，血管内皮生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，庆大霉素等）培养扩增内皮前体细胞。③取兔腹部皮下脂肪组织，胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞，Iseove改良的Dulbecco培养基培养扩增，将第2代脂肪干细胞传代后，分为2份，分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周，观察细胞的变化。用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定，观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞。结果：①原代内皮前体细胞接种后48h才能贴壁，生长非常缓慢，呈集落状生长，一般需要10d左右才能形成较大的集落，达到传代的目的，传代细胞生长迅速。内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长。②脂肪干细胞培养无需刺激因子，原代细胞接种12h后即开始贴壁，继而迅速进入对数生长期，无集落形成，原代和传代细胞均生长迅速。将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后，细胞形态未见明显变化，但与内皮前体细胞一样，大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性；培养3周后细胞的贴壁习性改变，几乎所用细胞均为阳性．而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性。③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高，培养后能保持旺盛的分裂能力；老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少，有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞，而且培养时细胞容易老化，表现为细胞体积增大，形态呈扁平状或不规则，细胞浆增多而核变小。壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别。结论：①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单，它不需要多种细胞因子刺激即可生长。②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞。③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞，其体外增长和分化能力受年龄影响较小，而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大。     

脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子及纤维蛋白胶复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景:血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的:观察脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子和纤维蛋白胶复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法:从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪干细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成5×1010L-1细胞悬液。由0.5mL细胞悬液、100μL的血管内皮生长因子工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论:术后8周取材时:①实验组可见血管增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;对照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大于对照组(P<0.01)。②苏木精-伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组(P<0.01)。③新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。结果说明脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子和纤维蛋白胶复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪干细胞与外源性血管内皮生长因子共同参与新生脂肪组织的血管化过程。     

pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的:检测pcDNA3.1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验于2005-07/2006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。①pcDNA3.1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只,无菌条件下取胫骨和股骨,进行骨髓基质干细胞的分离与培养。③转染前24h计数细胞,每孔5×105细胞接种于6孔板,待骨髓基质干细胞达到80%～90%融合时准备转染,设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理,空载体组转染pcDNA3.1载体,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165。④转染后72h,反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达;酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果:①骨髓基质细胞分离培养形态观察:初始分离的骨髓细胞呈圆形,大小不一;24h后有少量细胞贴壁;48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞;72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加;96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞;分瓶后细胞形成克隆;传代后细胞贴壁生长,分裂相增多,并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况:反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带,空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果:酶联免疫吸附结果显示,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为(170.1±14.3)ng/L,而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达,差异有显著性意义(t均=42.206,P=0.000)。结论:应用pcDNA3.1-VEGF165载体转染,可使兔骨髓基质干细胞获得外源性血管内皮生长因子165基因和蛋白的表达。     

脐血干细胞移植2型糖尿病下肢血管病变患者内皮依赖性血管舒张的变化

背景：研究表明,干细胞在一定诱导条件下可分化成为血管性内皮细胞,促进局部血管再生,生成新的毛细血管网,建立丰富的侧支循环,以达到改善和治疗下肢缺血的目的。目的：观察脐血干细胞对2型糖尿病合并血管病变患者内皮依赖性血管舒张功能的影响。方法：100例2型糖尿病下肢血管病变患者分为两组,试验组60例,对照组40例,试验组静脉输注脐血干细胞,对照组输注生理盐水,4周后比较两组基础指标及内皮依赖性血管舒张功能。结果与结论：试验组治疗后空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油水平较治疗前均明显下降（P〈0.05）,空腹胰岛素、餐后2 h胰岛素、血管内皮舒张功能较治疗前均明显升高（P〈0.05）。对照组空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、胆固醇、三酰甘油、血管内皮舒张功能治疗前后差异无显著性意义（P〉0.05）。结果表明脐血干细胞移植可以改善2型糖尿病下肢血管病变患者的内皮功能,促进侧支循环,避免糖尿病足的发生。     

人脂肪神经干细胞移植对大鼠脑缺血后血管新生和细胞因子的作用

背景:大鼠脑缺血后植入脂肪源性神经干细胞可一定程度上恢复神经功能,但具体机制尚不清楚.目的:探讨人脂肪组织来源的神经干细胞移植后,对缺血性脑损伤人鼠血管新生和血管内皮生长因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-12/2008-07d在华北煤炭医学院中心实验室及形态实验室完成.材料:脂肪组织来源于北京通州区第二医院收治的去除腹部多余脂肪的健康女性.健康雄性SD大鼠50只,随机分为正常对照组5只、假手术组5只、模型对照组20只、细胞移植组20只.方法:无菌条件下分离培养人脂肪组织来源的基质细胞,胰酶消化后取第5代细胞向神经干细胞诱导分化,移植前行BrdU标记,细胞浓度调整为4×109L-1.模型对照组、细胞移植组大鼠采用线栓法复制局灶性脑缺血2 h冉灌注模型,造模1 d后细胞移植组经尾静脉注入0.5 mL人脂肪组织来源的神经干细胞悬液,模型对照组同法注入等量生理盐水.主要观察指标:免疫组织化学染色检测缺血区脑组织微血管密度,利用原位杂交技术观察缺血区脑组织血管内皮生长因子mRNA表达的动态变化.结果:缺血再灌注1周时缺血区皮质即可见大量的微血管增生,2周时微血管密度达高峰.第4,12周时有所下降,但缺血再灌注后各时间点细胞移植组缺血区脑组织微血管密度均显著高于模型对照组(t=4.859,P＜0.05).脑缺血再灌注1,2周时,缺血区脑组织中可见大量的血管内皮生长因子mRNA阳性细胞,阳性信号主要分布于皮质及血管周围的神经细胞;第4,12周时模型对照组血管内皮生长因子mRNA阳性信号减弱,而细胞移植组阳性信号仍呈较强表达(t=5.894,P＜0.01).结论:人脂肪组织来源的神经干细胞可能通过促进微血管增生、提高血管内皮生长因子mRNA表达来加快缺血区血运修复,从向改善脑缺血人鼠的神经功能.     

趋化因子及其受体与肿瘤血管生成

正肿瘤血管生成与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关[1],当肿瘤大小超过1~2 mm3时,其继续生长依赖于血管新生。新生血管生成是不同血管生长形式的统称,包括毛细胞生成(capillary angiogenesis,已有毛细血管建立的毛细血管网络)、动脉生成(anteriogenesis,已有动脉血管直径加粗)和毛细血管丛生成(casculogenesis,内皮前体细胞形成毛细血管丛)[2]。     

造血调控相关的细胞因子与血管内皮祖细胞

血管内皮祖细胞是一类能循环、增殖并能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞.研究血管内皮祖细胞对于了解成人生理性和病理性血管形成的过程有重要意义,而细胞因子尤其是造血调控相关的细胞因子作为体内的细胞刺激物质对血管内皮祖细胞也有重要作用.本文将对血管内皮祖细胞和一些造血调控相关的细胞因子（G-CSF、EPO、HAPO和IL-18）的关系及其可能的信号传导途径的研究进展作一综述.