反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究

应用分子克隆技术将人FasLcDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN ,构建重组质粒pL (hFasL AS )SN ,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清 ,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株HepG2细胞并筛选建系 ,命名为HepG2 hFasL AS。半定量RT PCR检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的mRNA明显少于正常HepG2细胞 ;FACS检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的表达与HepG2细胞相比显著下降 ;同时 ,HepG2 FasL AS细胞导致HL 6 0细胞凋亡能力有所下降。表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴度测定及整合检测

为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力 ,本实验使用 Wizard TMDNA纯化系统对构建成功的三种反义 c- myc逆转录病毒表达载体进行了纯化 ,并经脂质体介导包装 PA317细胞 ,使用 NIH 3T3细胞测定了 PA317抗性细胞克隆的病毒滴度 ,用 neo基因 PCR扩增检测外源基因的整合情况。结果显示纯化后的DNA达到了真核细胞转染的要求 ,但其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、 PA317抽样量的高度影响 ,而neo基因 PCR检测是一种敏感、经济和可靠的基因整合检测法     

逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

目的 探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法 将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中,以潮霉素B筛选克隆细胞,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果 成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE／tk,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论 通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养30h和10mmol／L丁酸钠浓度下,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。     

hTrx基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建携带人Trx(硫氧还蛋白 )基因的逆转录病毒载体。方法 :用DNA重组技术 ,将人Trx基因定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN ,用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定。以磷酸钙转染法 ,将重组的逆转录病毒载体转染入包装细胞系PA317,并用G4 18筛选的方法测定转染细胞上清中病毒的滴度。结果 :构建了重组逆转录病毒载体 ,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切 ,电泳出现两个条带 ,分别为 0 .3kb和 5 .9kb。转染细胞上清中病毒滴度为 5 .5× 10 9cfu/L。提示构建携带人Trx基因的逆转录载体成功。结论 :携带人Trx基因的逆转录病毒载体成功构建为Trx基因的治疗、实验研究奠定了基础     

高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用

目的:构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,并与传统的逆转录病毒载体系统做比较。方法:首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上,构建携带内部核糖体进入位点(IRES)基因的逆转录病毒载体pC-MMP-IRES-GFP。将嵌合T细胞受体基因插入该载体中,与另外两个辅助载体pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T。48h后收培养上清,高速离心病毒。同时将嵌合T细胞受体基因插入传统的逆转录病毒载体pLXSN中,并转染包装细胞PA317,用G418加压筛选出转染的PA317细胞克隆。扩大培养48h后,收细胞培养上清即为病毒液,分别用上述两种方法得到的病毒液感染NIH3T3细胞,检测病毒的滴度。取适量病毒液感染用PHA激活后的人原代T细胞,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光,并用流式细胞术(FCM)检测病毒感染的效率。结果:成功地构建逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP。将目的基因插入该载体中,与pMD.MLVgag.pol和pHDM.G共同转染包装细胞293T。培养48h后,离心收获浓缩的上清中含有滴度为2.15×1011VP/L的病毒。以其感染用PHA激活后的人原代T细胞48h后,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。FCM检测病毒对T细胞的感染效率为50%~60%,并可用FCM进行分选。而用pLXSN载体转染的PA317细胞,包装得到的病毒滴度为6.43×109VP/L,病毒感染T细胞的效率仅为5%~10%。结论:构建了能高效转染T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统,为T细胞的基础与临床研究打下了基础。     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及转染神经干细胞的研究

应用基因重组技术将大鼠GDNF cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,经酶切及PCR对重组质粒进行鉴定.将重组体包装到PA317细胞中,并感染增殖旺盛的大鼠神经干细胞,通过免疫细胞化学、RT-PCR和western-blot等方法鉴定转染效率.结果显示GDNF cDNA正确地克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,该真核细胞表达载体成功转染增殖旺盛的神经干细胞并有效表达.因此本研究成功构建了GDNF真核细胞表达载体,并成功转染到神经干细胞中.为移植替代和基因治疗神经系统疾病提供了实验基础.     

表达反义c-myc RNA的重组逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的逆转作用

为研究表达反义c－mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理，利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c－mycRNA的质粒，经病毒包装细胞PA317包装后，使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC－2细胞，经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC－2细胞中均有病毒的高表达，体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC－2细胞中有高表达的反义c－mycRNA，而内源性c－mycRNA的表达明显受抑；Westernblot分析发现c－myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c－mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明：表达反义c－mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

三种反义c-myc逆转录病毒表达载体的纯化、病毒包装、滴工测定及整合检测

<正> 为了增强逆转录病毒构建体对靶细胞的转染能力,本实验使用Wizard~(TM)DNA纯化系统对构建成功的三种反义c-myc逆转录病毒表达载体进行了纯化,并经脂质体介导包装PA317细胞,使用NIH3T3细胞测定了PA317抗生细胞克隆的病毒滴度,用neo基因PCR扩增检测外源基因的整合情况.结果显示:1.纯化后的DNA260mm和280nm的OD值均大于1.8,且在琼脂脂糖电泳电中未有明显的RNA出现,说明DNA达到了真核细胞转染的要求,经灭菌和浓度调整后即可用于细胞转染.2.经测定,PA317的病毒滴度达到10~4级,这主要是因为病毒的感染效率不仅直接受病毒载体类型的影响,而且其包装滴度的高低还受靶细胞生长状态、PA317抽样量的高度影响.3.目的基因整合的检测;在所有抽取的转基因克隆细胞的基因组DNA中均能扩增出一条特异的、长430bp的neo基因片断电泳条带,而未转染组则无此条带.在检测基因转染后是否发生了染色体整合上,可用用Southem杂     

小鼠IL-23基因的克隆和在逆转录病毒中的表达

从肿瘤组织 (含有活化的淋巴细胞 )提取总RNA ,经逆转录多聚酶链反应 (RT PCR )获得小鼠IL 2 3cDNA。经DNA测序分析 ,证实该片段与GeneBank记载的IL 2 3cDNA序列一致。将该目的基因插入LXSN逆转录病毒载体 ,并转染大肠杆菌DH5α中扩增 ,再感染 ψ2 (ecotropic )和PA317(amphotropic )两种包装细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 3分子的PA317阳性细胞克隆。通过用PCR、RT PCR及Northernblot技术检测目的基因表达 ,结果表明 ,成功地将鼠IL 2 3cDNA插入逆转录病毒载体 ,经转染两种包装细胞产生了高表达IL 2 3的PA317细胞克隆。该克隆细胞产生的逆转录病毒可进一步用于转染肿瘤细胞 ,为制备肿瘤疫苗奠定了基础     

胰岛素样生长因子-1基因真核表达载体的构建

目的构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因重组逆转录病毒,为将IGF-1基因应用于神经系统疾病的治疗打下基础。方法质粒pcDNA3.1-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pLXSN-IGF-1,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染pLXSN-IGF-1至包装细胞pA317,检测培养上清病毒滴度。结果重组真核基因表达载体pLXSN-IGF-1经EcoR I和Xho I双酶切后,得到了400 bp和6.0 kb两条带;以重组体为模板进行PCR检测,400 bp的目的基因片段呈阳性;重组体测序结果与预期结果完全一致;建立了细胞系PA317-IGF-1,其培养上清平均病毒滴度为6.5×105CFU/ml。结论成功构建了IGF-1基因重组逆转录病毒。     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。     

猪FasL基因在猪软骨细胞上的表达和鉴定

目的: 实现猪Fas配体(FasL)基因在猪软骨细胞中表达和鉴定。方法: 用RT- PCR扩增猪FasL基因片段, 构建重组pGCEN-FasL逆转录病毒载体, 并转染PA317细胞。经G418筛选获得高滴度的病毒液, 感染猪软骨细胞, 应用FACS和Westernblot检测软骨细胞上FasL的表达。结果: 经酶切分析、测序证明, 成功地构建pGCEN- FasL逆转录病毒载体。转染的软骨细胞表面FasL的表达率为 57%。Westernblot显示, 在Mr为 37 000处有 1条特异性蛋白带, 具有诱导Fas 细胞凋亡的作用。结论: 成功地构建重组猪FasL基因的逆转录病毒载体, 并在转染的软骨细胞上高表达具有生物学活性的FasL, 为建立同种异体软骨细胞移植的免疫耐受提供了实验依据。     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

Construction and identification of rat GDNF gene recombinant retroviral vector and gene transfection to NSC

By genetic recombinant technique, the rat GDNF cDNA was recombinated to the retroviral vector pLXSN. The recombinant plasmid pLXSN-GDNF was verified by digestion with restriction endonucleases and PCR. Then neural stem cells (NSCs) were infected with pLXSN-GDNF. Immunocytochemistry, RT-PCR and western-blot were used to detect the transfection effect. Results showed that GDNF cDNA was cloned into retroviral vector pLXSN correctly, and the pLXSN-GDNF can infect NSCs efficiently. These results provide the possibility for transplantation and gene therapy with GDNF of nervous system diseases and injury.     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

逆转录病毒介导DNA修复蛋白在人骨髓细胞中的表达和抗性研究

目的增强造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因的特性和在造血细胞保护性基因治疗中的作用和意义.方法应用RT-PCR从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT,应用脂质体LipofectAMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,以BCNU加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染K562细胞和人造血细胞.应用PCR,Southernblot,RT-PCR,Westernblot及MTT法检测人MGMT基因在细胞中的转移和表达.结果酶切鉴定及DNA测序证实其MGMTcDNA克隆的正确性,脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞,BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达8.6×106CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在K562细胞及人造血细胞中获得有效转移和表达.结论MGMT耐药基因的成功克隆并导入骨髓造血细胞且获高效表达对开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础.