抗原致敏、GM-CSF基因修饰的树突状细胞诱导免疫杀伤多发性骨髓瘤细胞U266的研究

本研究探讨负载有多发性骨髓瘤细胞U266可溶性抗原并携带外源基因粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）的树突状细胞（DC）,在体外激活自身T淋巴细胞形成细胞毒T淋巴细胞（CTLs）对U266细胞的杀伤作用。用U266可溶性抗原致敏DC,再用含有外源基因GM—CSF的腺病毒感染DC,将所得的DC与T细胞混合培养以形成对U266具有特异杀伤作用的CTL,最后通过测定乳酸脱氢酶（LDH）以计算CTL对U266的杀伤率。结果表明：负载抗原及外源基因组、负载抗原组和对照组之间的杀伤率存在显著差异（n=3,F=10．939,P〈0．05）;两两比较表明,负载抗原及外源基因组的杀伤率高于其它两组（P〈0．001）,且负载抗原组高于对照组（P〈0．001）。结论：以U266可溶性抗原致敏的DC可诱导出对U266具有特异杀伤作用的CTL,当所致敏的DC通过腺病毒感染而带有外源基因GM—CSF时,所诱导的细胞毒杀伤反应则进一步增强。     

树突状细胞疫苗治疗多发性骨髓瘤的研究进展

近年来多发性骨髓瘤的发病率不断上升,但目前对于多发性骨髓瘤仍然没有很好的治疗方法。树突状细胞是一类抗原呈递细胞,具有启动和调控免疫反应的能力。利用肿瘤抗原冲击树突状细胞的免疫治疗策略已被证明是安全的并且对许多肿瘤具有一定的治疗效果。本文综述了多发性骨髓瘤相关的各种肿瘤抗原类型及树突状细胞免疫治疗多发性骨髓瘤的临床实验,并且分析了树突状细胞免疫治疗在未来实验研究方面的前景。     

多发性骨髓瘤患者树突状细胞缺陷及免疫治疗影响

多发性骨髓瘤是一种免疫功能障碍的B细胞恶性肿瘤,目前仍难以治愈.树突状细胞是机体内最重要最有效的抗原递呈细胞,在诱发抗肿瘤免疫应答中起关键作用.多发性骨髓瘤患者树突状细胞的缺陷与其体内免疫状态有着复杂的联系,对抗肿瘤免疫及免疫治疗极具影响.     

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol／L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin—V、线粒体跨膜电位（△ψm）和氧自由基（ROS），用半定量RT—PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin—V阳性细胞比例增高，△ψm降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用。其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。     

树突状细胞治疗多发性骨髓瘤的研究进展

树突状细胞 (ＤＣ)是机体内最重要的、作用最强的抗原提呈细胞 (ＡＰＣ) ,也是机体免疫应答的始动者 ,在机体抗肿瘤免疫应答中占有极其重要的地位。它作为一种天然的免疫佐剂 ,近年来在肿瘤免疫治疗中得到高度重视 ,并已试用于临床 ,取得了良好的疗效。多发性骨髓瘤 (ＭＭ)是一种浆细胞恶性增殖性疾病。ＭＭ分泌均一的单克隆免疫球蛋白 (Ｉｇ)或Ｉｇ片段 ,这种Ｉｇ是一种公认的肿瘤抗原 ,在发病过程中患者血浆中始终具有肿瘤细胞的个体独特型表型[1 ] ,且较容易大量获得 ,这为ＤＣ的免疫疗法提供了良好的物质基础 ,ＭＭ也因此成为探索ＤＣ疗…     

树突状细胞在多发性骨髓瘤治疗中的应用前景

利用树突状细胞(dendritic cells,DC)治疗多发性骨髓瘤(MM),从理论和临床实践上具有可能性与可行性。当MM处于进展期、肿瘤负荷很大时,单用DC恐难奏效,但对于经过大剂量化疗和外周血造血干细胞移植后的微小残留病灶(MRD),以DC为基础的免疫治疗可能有很好的临床应用前景。     

树突状细胞在多发性骨髓瘤治疗中的应用前景

利用树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ,ＤＣ）治疗多发性骨髓瘤（ＭＭ）,从理论和临床实践上具有可能性与可行性。当ＭＭ处于进展期、肿瘤负荷很大时,单用ＤＣ恐难奏效,但对于经过大剂量化疗和外周血造血干细胞移植后的微小残留病灶（ＭＲＤ）,以ＤＣ为基础的免疫治疗可能有很好的临床应用前景。     

多发性骨髓瘤主动免疫治疗的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)是B细胞恶性肿瘤,常规化疗的完全缓解率不超过5％,中位生存期短于3年。骨髓移植的广泛开展给治愈MM带来了新的希望,但复发是其最大的弊端。主动免疫治疗利用MM的独特型蛋白(idiotype Protein,Id),特异性地杀伤骨髓瘤细胞,有助于消除微小残留病变,提高患者的无病生存期。     

藤黄酸诱导骨髓瘤U266细胞凋亡及机制研究

目的探讨藤黄酸对人多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的影响及机制。方法不同浓度藤黄酸处理U266细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响,AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡,JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平,流式细胞仪检测荧光素激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞水平。结果藤黄酸呈浓度依赖性抑制U266细胞的生长,藤黄酸>0.5μg/ml才出现较明显的诱导凋亡的能力,藤黄酸降低U266细胞线粒体跨膜电位水平。藤黄酸作用U266细胞24h和48h时激活的Caspase3、Caspase8、Caspase9阳性细胞比例分别上升24.9%、31.7%、32.4%和57.0%、64.5%、63.5%。结论藤黄酸可抑制U266细胞的生长,机制与诱导U266细胞凋亡有关,线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径参与了凋亡的发生。     

多发性骨髓瘤主动免疫治疗的研究进展

多发性骨髓瘤（MM）是B细胞恶性肿瘤，常规化疗的完全缓解率不超过5%，中位生存期短于3年，骨髓移植的广泛开展给治愈MM带来了新的希望，但复发是其最大的弊端。主动免疫治疗利用MM的独特型蛋白（idiotype protein,Id)。特异性地杀伤骨髓瘤细胞，有助于消除微小残留病变，提高患者的无病生存期。     

树突状细胞介导的抗白血病效应的临床研究

肿瘤的免疫治疗作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，近年来受到了广泛的关注。树突状细胞(DC)是已知的功能最强的抗原呈递细胞，不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体免疫组织的抗肿瘤效应。为了探讨外周血来源的DC体外培养扩增和临床治疗的可行性和安全性，分析DC免疫治疗对于急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植患者长期生存的影响，利用CS3000Plus采集13例急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植后的病人的外周血单个核细胞，经过2周的体外培养后行DC免疫治疗，治疗后长期随访观察其无病生存时间。结果表明，无一例发现有与DC免疫治疗相关的严重不良反应；Kaplan-Meier生存分析结果为：DC组5年生存率为75．52％，非DC组5年生存率为45.71％，DC组在累计生存率上明显优于非DC组。结论：外周血来源的DC体外培养和临床治疗是安全可行的，急性非淋巴细胞白血病病人在自体骨髓移植术后应用DC免疫治疗延长了其无病生存时间，提高了长期生存率。     

大萼香茶菜甲素A通过抑制蛋白酶体诱导多发性骨髓瘤细胞株U266凋亡

本研究探讨大萼香茶菜甲素A（macrocalyxinA,MA）体外对多发性骨髓瘤细胞株蚤白酶体抑制作用及其诱导凋亡的分子机制。以不同浓度（2、4、8μgm1）的MA体外作用于U266细胞,用Hochest染色法和Annexin V／PI双染色观察MA诱导U266细胞凋亡作用;用Westernblot检测泛素、蛋白酶体19S亚基s6’亚单位和蛋白酶体20S亚基中β1、β1i、β2、β2i、β5、β5i亚单位,以及BAD、BCL-2、FAS、FAS-L、MAPK、PARP、Pro—caspase3、cleaved—caspase3蛋白的表达。结果表明,随着MA作用时间的延长和剂量的增加,Hoechst33258染色的细胞内出现致密颗粒或块状的荧光颗粒,AnnexinV＋／PI。细胞和总凋亡细胞（AnnexinV＋／PI-和AnnexinV＋／PI＋）增加;MA可使U266细胞内泛素化水平增高,抑制20S蛋白酶体亚单位β1i、β2、β5i、和19S蛋白酶体泛素识别亚基s6’表达。与此同时,BCL-2、MAPK、PARP、pro—caspase3表达随着药物作用浓度的增高而下调,BAD、FAS、FAS—L、cleaved—caspase3表达则增加。结论：大萼香茶菜甲素A具有抑制蛋白酶体的作用,线粒体凋亡和死亡受体途径有可能参与MA诱导细胞的凋亡。     

冬凌草甲素对多发性骨髓瘤抗肿瘤的机制研究

本研究探讨冬凌草甲素（Oridonin）对人多发性骨髓瘤（MM）细胞株U266抗肿瘤作用及其分子机制。CCK-8法检测冬凌草甲素对细胞增殖的影响;瑞氏染色法观察细胞的形态学改变;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR方法检测U266细胞FGFR3、BC12、CCNDJ、MYC基因表达水平的变化;Westernblot方法分析BCL2、MYC、CCNDl、FGFR3和P53蛋白表达水平的变化。结果表明,①冬凌草甲素能够抑制U266细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性;②10μmol／L冬凌草甲素处理U266细胞24h后,光学显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态学改变;③U266细胞凋亡比例随冬凌草甲素药物浓度及作用时间的延长而增加;④经冬凌草甲素处理后的U266细胞中,FGFR3、BCL2、CCNDJ、MYC基因表达下调,同时其相应的蛋白质表达下调,P53蛋白表达上调,上述变化均呈浓度和时间依赖性。结论：冬凌草甲素可以抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖并诱导其凋亡,发挥其抗肿瘤作用。本研究为MM新的靶向治疗方案选择提供理论依据。     

地西他滨对多发性骨髓瘤U266细胞株生物学行为的影响

本研究以多发性骨髓瘤U266细胞株为实验对象,探讨地西他滨对其生物学功能的影响,为MM的临床治疗提供新思路及实验依据,也为MM的发病机制提供进一步的佐证。应用MTT实验、平板克隆形成试验、FCM分析细胞周期、transw ell迁移及m atrigel侵袭试验分别检测地西他滨对U266细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果表明,地西他滨随着浓度增加对U266细胞增殖抑制作用增强,呈剂量和时间依赖性;FCM检测结果表明地西他滨处理后,G0-G1期U266细胞明显增加,S期和G2-M期细胞降低(p<0.05),表明地西他滨可抑制U266细胞DNA合成,将细胞周期阻滞在G0-G1期;低浓度(0.8mm o l/L)地西他滨处理后,U266细胞迁移能力及侵袭力明显降低(p<0.05)。结论:地西他滨对U266细胞的增殖、迁移、侵袭能力均有抑制作用,本研究为地西他滨应用于MM临床治疗提供了一定的实验依据。     

ROS在FTY720诱导U266细胞死亡中的作用机制研究

本研究探讨活性氧（ROS）在FTY720诱导多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡及自噬中的作用。不同浓度FTY720处理U266细胞24 h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,应用Western blot检测LC3B的表达。结果显示：应用FTY720可引起U266细胞发生凋亡及自噬,自噬的发生可促进细胞死亡。自噬抑制剂Bafilomycin A1可降低FTY720导致的细胞生存率下降。应用ROS抑制剂NAC或Tiron后,FTY720引起的细胞凋亡减轻,联合应用NAC或Tiron和FTY720后LC3B-Ⅱ表达较单用FTY720明显下降。结论：FTY720可诱导U266细胞发生凋亡及自噬,ROS是FTY720引起的多发性骨髓瘤细胞凋亡及自噬的共同调节剂。     

丙戊酸钠抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及组蛋白乙酰化调控的研究

本研究探讨丙戊酸钠（valproic acid sodium,VPA）对U266细胞增殖的抑制作用及对组蛋白乙酰化修饰调控的影响。采用CCK-8法检测VPA对U266细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测VPA作用前后U266细胞周期的变化,半定量RT—PCR检测VPA作用后U266细胞中组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）mRNA的表达变化,Western blot方法检测VPA作用后HDAC1及组蛋白H3、H4乙酰化蛋白水平的变化。结果表明,VPA对U266细胞增殖的抑制作用呈时间一浓度依赖性;2．5mmol／L的VPA处理细胞48小时后,细胞周期检测显示G0／G1期细胞比例增高,S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0／G1期（P〈0．05）;RT—PCR证实VPA能够抑制HDAC1mRNA的表达水平;Western blot方法证实不同浓度VPA作用细胞48小时后HDAC1蛋白水平降低,组蛋白H3、H4乙酰化表达水平提高。结论：VPA能够抑制U266细胞增殖,使细胞阻滞于G0／G1期,这可能与VPA抑制HDAC1表达,上调组蛋白H3、H4乙酰化水平有关。     

血小板对树突状细胞和肿瘤细胞抗原呈递活性的抑制作用

本研究探讨完整的血小板对骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和肿瘤细胞的抗原呈递功能的影响。抗原呈递检测体系采用BMDC诱导的混合淋巴细胞反应或肿瘤细胞系EG7（表达卵白蛋白OVA）诱导的OVA特异性T细胞的活化,共培养体系中加入从小鼠外周血分离的血小板至不同浓度,培养一定时间后采用同位素掺入法检测淋巴细胞增殖,采用ELISA检测各种细胞因子的水平,采用流式细胞术检测细胞表面分子情况。结果发现,在反应体系中加入血小板时,淋巴细胞增殖和IFN,,／产生均明显受抑制。血小板还可以阻断细菌脂多糖或含CpG基序的寡核苷酸引起的BMDC表面B7之上调、细胞因子分泌及对同种异基因淋巴细胞的刺激反应。血小板也可抑制BMDC特异性T细胞呈递可溶性或细胞性抗原的能力,表现为淋巴细胞的增殖和细胞因子分泌受到抑制。血小板的这些抑制作用均依赖于加至培养体系中血小扳的浓度。流式细胞术分析表明,血小板结合于BMDC仅轻微增加后者的死亡比例。结论：在某些条件下,血小板可以通过抑制抗原呈递功能而对免疫反应起到负向调控作用,血小板对免疫系统的调节可能比原来预期的更加复杂。     

美伐他汀对人多发性骨髓瘤细胞系U266体外增殖与凋亡的影响

为了探讨羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂对多发性骨髓瘤(MM)细胞增殖与凋亡的调控作用及机制，应用MTT比色法、光镜形态学观察、流式细胞术、DNA凝胶电泳及RT-PCR研究了美伐他汀(mevastatin)对MM细胞系U266细胞体外增殖与凋亡的影响。结果显示，美伐他汀以剂量及时间依赖方式抑制u266细胞增殖；细胞周期分析显示美伐他汀诱导u266细胞G0-G1期阻滞，但对p27蛋白及mRNA的表达无影响；在美伐他汀作用下U266细胞出现核染色质凝聚、核固缩、核碎裂等凋亡形态改变，PI Annexin V^ 细胞增多，线粒体跨膜电位(△φm)下降，DNA凝胶电泳出现梯形条带，bcl-2mRNA表达下调。加入外源性甲羟戊酸(meva-lonate，MVA)可完全逆转美伐他汀对U266细胞增殖与凋亡的效应。结论：美伐他汀可通过MvA途径，诱导G0-G1期阻滞抑制增殖、下调bcl-2表达及降低线粒体膜电位触发U266细胞凋亡。     

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。