弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,并构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-ESAT-6和重组耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,克隆入pGEMT载体。然后,构建亚克隆ps3000-ESAT-6大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将ESAT-6基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacteri-umsmegmatis mc~2155)中,热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察ESAT-6蛋白的表达,Western blotting鉴定其生物学活性。结果成功扩增了结核杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。结论ESAT-6重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG(BacilliCalmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

间日疟原虫pvMSP_(1-19)基因重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的体外扩增间日疟原虫pvMSP1-19基因,构建大肠埃希菌-穿梭质粒PMV261/pvMSP1-19和电转化耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链反应(PCR),体外扩增间日疟原虫的pvMSP1-19基因,克隆入PMD19-T载体,构建亚克隆PMV/pvMSP1-19大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒;电转化方法将PMV/pvMSP1-19穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。并热诱导此重组分枝杆菌,SDS-PAGE电泳观察pvMSP1-19蛋白的表达,Western blot鉴定其免疫学活性。结果成功扩增了间日疟原虫pvMSP1-19基因,并且正确构建PMV/pvMSP1-19穿梭质粒和转化耻垢分枝杆菌。采用Westernblot证实该重组耻垢分枝杆菌表达的pvMSP1-19蛋白能被间日疟患者的血清识别。结论构建的重组耻垢分枝杆菌能表达pvMSP1-19蛋白,该蛋白具有免疫反应性,为pvMSP1-19基因重组BCG疫苗的研制提供了必要的基础。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。     

细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌疫苗在小鼠体内的表达及其免疫应答

目的构建表达细粒棘球绦虫成虫特异性基因EgM123的耻垢分枝杆菌疫苗株,接种BALB/c小鼠,观察其免疫原性。方法 PCR扩增EgM123片段,定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中,构建重组质粒pMV261-EgM123。连接产物转化至大肠埃希菌DH5α中,培养后提取质粒,测序确定阅读框架正确,后电穿孔转入耻垢分枝杆菌,构建表达EgM123的重组耻垢分枝杆菌疫苗(rMS-EgM123),经热诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白表达。在培养过程中连续检测菌液A600值,绘制重组菌生长曲线。取重组菌接种小鼠,检测基础接种和加强免疫接种后血清特异抗体水平。结果 PCR扩增出大小为594bp的EgM123片段,EgM123基因正确插入到穿梭质粒pMV261中,测序鉴定阅读框架正确。重组耻垢分枝杆菌连续传10代培养,重组质粒DNA序列未发生变异。Western blot检测表达产物能被抗EgM123鼠血清识别。用重组耻垢分枝杆菌疫苗加强免疫后的小鼠血清特异性抗体呈持续上升趋势,单次加强免疫8周后抗体水平(A405值为2.504±0.659)显著高于亚单位疫苗组(P0.05)。结论重组耻垢杆菌疫苗菌能表达细粒棘球绦虫成虫EgM123蛋白,且该重组疫苗可通过加强免疫增强基础免疫诱导小鼠产生的抗体水平。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA2全基因的原核重组表达

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白2（GRA2）的全长基因,在大肠埃希菌工程菌中重组表达GST—His—GRA2融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA2基因全长,与pET-41Ek／LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠埃希菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,然后采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白产物。结果PCR鉴定弓形虫GRA2全基因重组表达质粒构建正确;诱导表达的GST—His—GRA2融合重组蛋白分子质量单位为52ku,与预测值相符。结论本研究成功构建了弓形虫GRA2全基因重组蛋白质粒,该质粒能表达GRA2蛋白,为研究GRA2与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定

目的　体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA1基因 ,并构建真核表达质粒。方法　从接种了弓形虫RH株的小鼠腹水中收集、纯化速殖子 ,提取基因组DNA ;据已知的GRA1基因列 ,设计合成一对引物 ,并引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。应用PCR技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段。扩增目的基因片段经纯化、双酶切后 ,插入真核表达质粒pEGFP -N3中 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,于卡那霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。重组子经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR鉴定。结果　从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出 785bp的GRA1基因片段 ,构建重组质粒pEGFPN3-GRA1,酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符。 结论　成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了GRA1基因 ,并构建了pEGFPN3-GRA1重组质粒。为重组质粒的进一步表达和核酸疫苗的研究创造了条件     

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅲ.pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫小鼠的保护性观察

目的观察重组质粒pcDNA3HBsAgGRA1DNA接种诱导的保护性免疫应答。方法质粒DNA免疫BALB/c小鼠;ELISA法检测GRA1、HBsAg抗体及亚类水平;提取各免疫组小鼠肌肉组织DNA进行PCR检测;弓形虫RH强毒株攻击感染各免疫组小鼠。结果经pcDNA3HBsAgGRA1免疫组小鼠产生抗GRA1和HBsAg抗体,且抗GRA1的抗体水平明显高于GRA1单独和GRA1与HBsAg混合免疫组。弓形虫RH强毒株攻击感染pcDNA3HBsAgGRA1免疫组小鼠,其存活时间明显长于其他各组,结果提示HBsAg可能起免疫佐剂作用。结论将GRA1与HBsAg融合明显增强了GRA1的免疫原性和保护性。     

利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3200bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。