利用膜片钳技术对小鼠嗅感觉神经细胞电生理学的初步研究

目的利用全细胞膜片钳技术初步探讨小鼠嗅感觉神经细胞的电生理学特性。方法取生后7～14d的昆明小鼠的嗅黏膜，用胰蛋白酶消化组织，获取单个嗅感觉神经细胞，并用全细胞膜片钳技术对急性分离的嗅感觉神经细胞的离子通道进行记录和分析。结果急性分离的小鼠嗅感觉神经细胞的功能状态良好，在膜片钳记录过程中细胞与记录电极之间能形成高阻封接，并可记录到电压门控性的内外向电流。内向电流具有快速激活和失活的特性，并可被0．1μmol／L河豚毒（TTX）完全阻断，说明内向电流主要由Na^＋介导；外向电流包含有瞬时成分和持续成分，并可被CsCl完全阻断，说明外向电流主要由K^＋介导。结论急性酶分离的小鼠嗅感觉神经细胞的电生理学特性的初步研究，为嗅觉传导机制和药理学的研究提供依据和指导。     

一种改进的适用于膜片钳技术的海马神经元分离方法

目的探讨获得适用于膜片钳技术的单个海马神经元的方法。方法取3～6日龄Sprague-Dawley新生大鼠10只,应用酶消化及机械分离法,急性分离出大鼠海马神经元,通过倒置显微镜直接观察和全细胞膜片钳技术分别对分离得到的海马细胞的形态学和电生理学特征进行研究。结果急性分离所得海马具有锥形胞体的顶树突特征,立体感强。在全细胞膜片钳记录模式下可记录到全细胞电流及钠通道电流,该电流可被1μmol·L~(-1)的河豚毒素完全阻断。结论应用该酶消化及机械分离法急性分离的新生大鼠海马神经元形态和生理特性良好,适用于海马神经元的膜片钳研究。     

三叉神经节细胞电压门控通道研究中的钙电流振荡活动

目的 :探讨三叉神经节细胞电压门控性钙通道电流特性。方法 :在急性分离的三叉神经节细胞膜上 ,阻断电压门控性延迟整流钾通道和电压门控性钠通道 ,在 - 70mV的钳制电位下 ,给予 1 0mV步幅递增、80ms步宽的去极化脉冲刺激 ,进行全细胞膜片钳记录。结果 :在仅阻断电压门控性延迟整流钾通道时 ,- 1 0mV的去极化脉冲刺激激活了三叉神经节细胞膜上继快钠电流之后的慢内向电流 ,呈重复开闭的振荡特性 ;同时阻断电压门控性延迟整流钾通道和电压门控性钠通道 ,在 - 2 0mV的去极化脉冲刺下 ,也可记录到呈振荡特性的慢内向电流。振荡电流可被细胞外喷射的 1mmol·L-1 尼福地平所阻断。结论 :三叉神经节细胞膜上高电压激活的重复开闭慢内向电流可能为电压门控性钙电流 ,其振荡特性可能与感觉信息中枢传入的初级加工有关。     

人骨髓间充质干细胞全细胞钙离子通道电生理实验研究

目的:探讨入骨髓间充质干细胞钙离子通道的电生理学特性.方法:采用梯度离心法和单层贴附培养法分离,纯化,获取人骨髓间充质干细胞,并对所获取的P1～P2代骨髓间充质干细胞的钙离子通道进行全细胞膜片钳的记录与分析.结果:在骨髓间充质干细胞膜上可记录到对Nicardipine敏感的钙离子通道电流,在阻断膜上钠、钾电流后,当钳制为-90mV,膜上钙电流可被连续记录,从-110～-10mV持续钳制用10mV阶跃去极化,在-60mV获得钙离子通道的反转电流.结论:骨髓间充质干细胞膜上用全细胞膜片钳可记录到钙离子通道电流,其电生理学特性符合非兴奋细胞膜上的钙离子通道特点.     

小鼠脑动脉平滑肌钙激活钾通道基本特性和动力学调控研究

目的采用膜片钳技术记录小鼠脑动脉平滑肌细胞上的大电导钙激活钾通道(BKCa)和自发瞬时外向电流(STOCs),研究了其基本特性以及钙离子对通道动力学的调控。方法采用两步法急性酶分离小鼠脑动脉,得到单个平滑肌细胞。使用200μg/mL两性霉素B为穿孔剂进行穿孔全细胞膜片钳实验,包括全细胞宏观电流记录和STOCs记录,采用inside-out和outside-out构型进行单通道电流记录。结果 BKCa宏观电流和STOCs能够被BKCa的特异性阻断剂IbTX(200nmol)阻断。BKCa单通道具有明显电压依赖性(半数最大激活电压V1/2=78.09mV)、K+选择性和钙敏感性(Ca2+解离常数Kd=0.881μmol),能够被胞外IbTX阻断。胞内Ca2+调控通道动力学特性主要表现为减少了开放时间常数,促进了通道由关闭向开放的转变。结论 BKCa宏观电流和STOCs非常容易记录,单通道活性好,具有BKCa的电生理学特性。小鼠脑动脉平滑肌是研究BKCa功能活动和血管活性药物作用机制的良好实验标本。     

吗啡慢性处理对大鼠前额叶皮层神经元瞬时外向钾电流的影响

目的：本实验用全细胞膜片钳技术观察吗啡对大鼠前额叶皮层神经元瞬时外向钾电流（IA）的影响。方法：实验中用终浓度为10μmol／L的吗啡处理细胞48h,采用全细胞膜片钳技术记录IA,进行以下方面的实验：培养大鼠皮层神经元IA的特性及鉴定;吗啡对神经细胞IA的电流密度-电压曲线（I—V曲线）的影响。结果：记录到一快速激活并快速失活的外向电流,该电流可被2mmol／L的特异性IA阻断剂4-AP阻断;吗啡慢性处理能引起大鼠皮质神经细胞IA增强,当膜电位在-25mV～＋65mV时,吗啡慢性处理组电流密度明显高于对照组。结论：吗啡能引起神经细胞IA增强．使神经元处于超极化状态,导致其活动抑制。     

小鼠粗线期精母细胞钙离子通道膜片箝方法的建立

应用机械分离获得小鼠单个精母细胞，采用全细胞膜片箝技术记录Ca^2 离子通道电流。结果表明：①阻断K^ 电流后，当钳制电位－90mV、指令电压－60～＋10mV、步阶电压10mV时，可记录到内向电流；②内向电流在－30～－40mV达到最大值；③在细胞外液中加入4μmol/L TTX，对记录电流无影响，表明此电流不含有Na^ 电流成分，为Ca^2＋电流。     

果蝇晚三龄幼虫脑神经元的快速分离与鉴定

目的探索果蝇晚三龄幼虫脑神经元急性分离的新方法,并对分离制备的脑细胞进行形态学观察和电生理学记录。方法解剖果蝇晚三龄幼虫脑组织,用胶原酶化学消化并辅以机械微振荡法分离制备单个细胞,用果蝇细胞培养液适当孵育。在倒置相差显微镜下对其进行形态学观察和分类,结合全细胞膜片钳技术对其电生理学特征进行初步研究。结果成功制备出三类大小和形态各异、活性较好的果蝇脑神经元．未见神经胶质细胞;以三型细胞为电生理学研究对象,记录到五种类型的全细胞外向钾电流。结论新建立的果蝇晚三龄幼虫脑细胞急性分离方法简便易行,稳定可靠。     

大鼠海马神经元大电导钙激活钾通道的全细胞电流记录

目的 探讨记录全细胞的大电导钙激活钾通道的技术方法。方法 首先酶解急性分离大鼠海马神经元；利用全细胞膜片钳技术记录大电导钙激活钾电流。结果 可记录到一系列快速的外向钾离子电流。结论 所记录到的外向钾离子电流中，快速出现并很快减小的呈尖峰样的瞬变外向电流主要由大电导的钙激活钾电流组成。     

急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度

目的 在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2 电流(Ica)和Ca2 浓度[Ca2 ].的变化.方法 改良Langendroff法,用含胶原酶Ⅰ(1750 U/mL)和蛋白酶XⅣ(0.28 mg/mL)的无Ca2 台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ica,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞[Ca2 ]i的变化.结果 在20 rmin内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞Ica,1μmol/L异丙肾上腺素可显著增加Ica;并观察到心室肌细胞[Caa2 ]i以及电刺激增强[Ca2 ]i的效应.结论 大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验.     

大鼠皮层神经元急性分离改良方法

目的建立一种适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离改良方法，并对其离子通道电流进行记录。方法采用酶加机械分离法制备12—16d鼠龄的大鼠皮层神经元。其电生理学特性测定用全细胞膜片钳技术。结果分离出的神经元形态正常，有较长的轴突；用膜片钳技术证实，其保存了主要的离子通道活性。结论成功建立了一种简单快速的适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离改良方法。     

依达拉奉体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理研究

目的探讨新型氧自由基清除剂依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理特性。方法Ficoll-Paque分离液离心分离大鼠骨髓基质干细胞,体外扩增,含依达拉奉的无血清L-DMEM诱导。观察细胞形态变化,Western-blot检测分化前后细胞膜离子通道蛋白表达,全细胞膜片钳检测细胞电生理特性。结果分化的骨髓基质干细胞胞体收缩,突起伸出;钠、钾、钙膜蛋白分化前后均有表达,分化后钾、钠、钙膜蛋白表达上调;分化后细胞静息电位值增大,外向电流增大,尤以外向整流钾电流显著。结论依达拉奉诱导大鼠骨髓基质干细胞分化的细胞具有神经细胞电生理特性。     

细胞外液酸碱度对主动脉平滑肌细胞电生理的影响

目的 :探讨细胞外液酸碱度 ( p H0 )的改变对主动脉平滑肌细胞电生理特性的影响。方法 :通过改变培养的乳鼠主动脉平滑肌细胞外液的酸碱度 ,应用全细胞膜片钳技术记录细胞膜的变化和钾离子通道活动的情况。结果 :p H0 降低时引起细胞膜超极化 ,外向钾电流增大 ;反之 ,p H0升高时引起细胞膜去极化 ,外向钾电流减小。这种变化可以被 TEA阻断 ,而对 4- AP不敏感。结论 :p H0 改变引起主动脉平滑肌细胞膜电位及外向电流幅值变化 ,其机制可能与钙激活性钾通道的开放几率有关     

IL-1β和IL-2对大鼠脑片视上核神经元膜电特性的影响

目的　研究细胞因子 IL- 1β和 IL- 2对大鼠视上核(supraoptic nucleus,SON )神经元膜电特性的影响 ,并探讨其细胞机制 .方法　采用脑片全细胞膜片钳记录技术 ,分别在电流钳和电压钳状态下记录大鼠 SON神经元的膜电位和全细胞电流 .结果　 10 0 0 0 0 U· L- 1 的 IL - 1β可使大鼠 SON神经元超极化 (3.4± 1.3) m V,且伴自发放电频率下降 ,在电压钳状态下可记录到一外向电流 ;10 0 0 0 0 U· L- 1 的 IL - 2可使大部分 SON神经元超极化 (2 .9± 1.2 ) m V,伴自发放电频率下降 ,电压钳状态下可记录到一外向电流 .结论　细胞因子 IL - 1β和 IL - 2可抑制大鼠 SON神经元的膜电活动 .     

急性分离大鼠皮层神经元的方法与体会

目的：建立急性分离大鼠皮层神经元的方法。方法：切取活脑组织切片,经Protease酶解消化、孵育后,采用酶加机械分离法制备10~16 d鼠龄的大鼠皮层神经元。作形态学观察,用全细胞膜片钳技术记录其电生理学特性。结果：分离出的神经元倒置相差显微镜下形态保持良好,有较长的轴突;用膜片钳技术证实,80%以上细胞可以记录出电活动,其保存了主要的离子通道活性。结论：成功建立了一种经济、简便的适用于膜片钳技术的大鼠皮层神经元急性分离方法。     

心肌细胞的急性分离及瞬时外向钾电流的记录

目的在利用全细胞膜片钳技术研究离子通道时,分离出结构功能完整、生理状态良好、耐钙的单个心肌细胞至关重要,文中主要探讨心肌细胞分离及瞬时外向钾电流记录的影响因素。方法使用改良的体外心脏恒温灌流,酶解消化得到单个心肌细胞,并采用全细胞膜片钳技术记录瞬时外向钾电流。结果用全细胞膜片钳技术可获得生理状态良好的心肌细胞,并成功的记录到瞬时外向钾电流。结论全细胞膜片钳技术方法简便、稳定,细胞存活率高,并且易于进行全细胞膜片钳实验。     

昆明小鼠心室肌细胞分离及钙电流观察

目的：探索建立简单实用的小鼠心肌细胞分离方法并观察其钙电流特征,以便有利于心肌细胞电生理和分子生物学研究。方法：采用下腔静脉灌流,原位主动脉插管和胶原酶Ⅱ消化法得单个心肌细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,利用全细胞膜片钳技术记录钙电流。结果：分离得到的心肌细胞数量多、存活率高、杆状、横纹清晰、折光性好、静止、贴壁良好。逐步复钙后可获得50%～60%耐钙细胞,单个心肌细胞在全细胞膜片钳模式下可记录到典型的L-型钙电流,在细胞外液加入尼群地平后L-型钙电流消失。结论：该心肌细胞分离方法简单实用,重复性好,所获得的单个心肌细胞具有正常的电生理活性。     

大鼠心室肌细胞的分离及其钙电流的观察

目的：探讨大鼠心肌细胞酶急性分离的方法，并观察大鼠心室肌细胞膜钙电流。方法：采用Lngendorff灌流装置，用含胶原酶P(0．12g/L)的台式液，经主动脉逆行灌流心脏，分离心肌细胞；采用膜片钳全细胞记录的方法，观察记录大鼠心室肌细胞膜L型钙电流。结果：心肌细胞的存活率约70％-80％，形态呈长杆状，横纹清晰，膜良好。膜片钳全细胞记录出电压依赖性内向电流，其激活电位-30mV，最大激活电位0mV，反转电位50mV，并且此内向电流可被钙通道阻滞剂维拉帕米抑制。结论：用此法可分离出高存活率的心肌细胞，并具有正常的电生理特性。     

小鼠肾近曲小管上皮细胞顶侧膜钾通道的膜片钳研究

目的研究小鼠肾脏近曲小管上皮细胞顶侧膜K 通道的生理学特性.方法采用膜片钳细胞贴附式单通道记录急性分离的近曲肾小管上皮细胞顶侧膜K 通道电流.结果该通道在超极化状态下表现为内向电流,斜率电导为(11.4±0.6)pS,且通道开放活动随极化程度增大而增加.在反极化状态下表现为外向电流,并具有内向整流特性.结论小鼠肾脏近曲小管上皮细胞顶侧膜上存在一类低电导的K 通道,其分布广泛,可能参与钾离子转运、调节细胞体积及维持电势能的稳定.     

水杨酸钠对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流及其尾电流的影响

目的 采用全细胞膜片钳技术记录耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons,SGNs)外向整流钾电流及其尾电流,分析水杨酸钠对耳蜗SGNs外向整流钾电流及其尾电流的影响,初步探讨其耳毒性机制.方法 采用全细胞膜片钳技术记录急性分离并进行细胞短时间(2～3 h)血清培养后,耳蜗SGNs外向延迟整流钾电流及其尾电流曲线,同时记录不同浓度水杨酸钠(0.01、0.1、0.5、1、10 mmol/L)对2种电流的影响.结果耳蜗SGNs上可记录到外向电流,该电流对4-氨基吡啶(4-AP)敏感,证明其为钾电流,该钾电流具有延迟整流特性;1 mmol/L水杨酸钠能明显抑制耳蜗SGNs外向延迟整流钾电流;+50 mV的去极化电压刺激可使最大稳态电流幅值减少(46.3±2.0)%,水杨酸钠对此电流的抑制具有浓度依赖性,外液洗脱后耳蜗SGNs外向延迟整流钾电流可基本恢复正常.另外,可记录出耳蜗SGNs延迟整流钾电流的尾电流曲线;水杨酸钠可降低此尾电流峰值,并缩短尾电流的时间常数,加速尾电流的失活.结论 钾电流在耳蜗SGNs正常电生理活动中有重要作用.水杨酸钠抑制耳蜗SGNs外向整流钾电流及其尾电流,并加速尾电流的失活,这种作用可导致耳蜗SGNs的电生理活动异常,从而引发水杨酸钠对听觉功能的损害.