反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF的构建与鉴定

目的构建反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF。方法从人外周血细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成人cDNA文库。设计带有酶切位点的引物,调取VEGF目的基因,插入pShuttle-GFP-CMV穿梭载体。经鉴定序列正确后,将VEGF目的基因构建至亚克隆重组腺病毒质粒pAdxsi中。结果成功构建反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF,经酶切鉴定,目的基因分子量与预计的相同,测序插入载体部位正确。结论反义重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-hVEGF构建正确、稳定,为进一步抑制人VEGF基因的表达和体内外实验打下了良好的基础。     

携hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法　将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果　重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论　构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。     

反义VEGF165真核载体的构建

以质粒pcDNA3.1为载体，将血管内皮基因（VEGF）165cDNA片段反向插入得到反义VEGF165真核表达载体，经过酶切电泳和基因测序证实获得的载体插入方向正确，可以进一步用于反义基因表达的实验研究。     

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使 VEGF基因的高效转染成为可能     

EGFR反义重组腺病毒治疗乳腺癌的实验研究

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)反义重组腺病毒AdE5对乳腺癌细胞移植瘤的作用。方法:人乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于裸鼠右侧背部皮下形成肿瘤后,以AdE5、空病毒载体AdCO1瘤内注射,每只109pfu/100μl。共注射2次。定期测量肿瘤体积,计算相对生长率。肿瘤组织HE染色后做组织学观察,以免疫组化分析K i-67表达。结果:AdE5瘤内注射可抑制肿瘤生长(相对生长率<1)。组织学研究显示肿瘤内坏死明显,免疫组化分析发现AdE5治疗后肿瘤K i-67指数显著低于AdCO1及PBS组。结论:以腺病毒载体介导的EGFR反义RNA转导可有效地抑制乳腺癌细胞的在体肿瘤生长。     

腺病毒介导的反义VEGF165对人皮肤恶性黑色素瘤细胞生长的影响

目的:用腺病毒介导的反义VEGF165(Ad-aVEGF165)转染人血管内皮细胞系(ECV304)和人皮肤恶性黑色素瘤细胞系(A375)后,观察Ad-aVEGF165对这两细胞系体外生长的影响.方法:用感染复数为100的Ad-aVEGF165分别转染上述细胞,测定其生长曲线(MTT法)、细胞周期、VEGF基因的表达.结果:转染Ad-aVEGF165基因的A375细胞上清能够抑制ECV304细胞的生长,其增殖指数下降.Ad-aVEGF165对A375细胞的生长、增殖指数无明显影响,但是它能抑制A375细胞VEGF的表达.结论:①ECV304细胞不表达VEGF,Ad-VEGF 165对ECV304细胞无直接影响,必须要经过A375细胞介导才能抑制ECV304细胞的生长;②在体外,Ad-aVEGF165不能直接抑制A375细胞的生长,但能抑制A375细胞分泌VEGF.     

小鼠MK基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的死亡受体(Mouse killer,MK)基因干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒并在小鼠子宫基质细胞中鉴定其干扰作用.方法:人工合成靶向MK的siRNA干扰序列,将其克隆到穿梭载体psES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-MKsiRNA,在HEK293细胞中包装并扩增腺病毒颗粒.用纯化后的腺病毒混合液感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞,RT-PCR及Western Blot检测基质细胞中MK的mRNA及蛋白表达水平.结果:Adeasy-SES-HUS-MKsiRNA混合液均效价为6.8 X 10~(11)pfu/ml,感染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,MK的mRNA及蛋白水平均显著下调.结论:构建的MK干扰表达腺病毒能有效地抑制MK基因的表达,为进一步研究MK在小鼠子宫基质细胞的功能提供了有效的工具.     

血管内皮生长因子165反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的 探讨应用血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）反义ＲＮＡ治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建和鉴定反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体;将其转染入人脑胶质瘤细胞ＳＨＧ４４,检测其转染前、后的生物学性状;比较转染前、后ＳＨＧ４４细胞的裸鼠皮下致瘤性;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果 成功构建反义ＶＥＧＦ１６５真核表达载体并在ＳＨＧ４４细胞获得表达,该细胞     

p27kip1复制缺陷腺病毒重组体的构建与鉴定

目的 :构建含人细胞周期依赖激酶抑制剂p2 7kip1基因的重组腺病毒载体 ,为采用p2 7kip1cDNA防治肿瘤的研究奠定基础。方法 :将人p2 7kip1cDNA插入到穿梭质粒pACCMVPLPA的CMV启动子之下 ,即pAd p2 7kip1。后者与pJM17通过脂质体共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒Ad p2 7kip1。结果 :p2 7kip1cDNA成功地插入了pACCMVPLPA载体 ,以重组病毒基因组DNA为模板 ,同时扩增出了 2 75bp的p2 7kip1基因片段和 86 0bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了Ad p2 7kip1的正确性。病毒滴度为 1.2 4× 10 1 2 pfu ml。结论 :成功构建了携带人p2 7kip1基因的腺病毒Ad p2 7kip1,为采用p2 7kip1cDNA途径防治消化道肿瘤的在体、离体实验奠定了基础     

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法：RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段，插入pMDl8-T载体中，经SalⅠ、BglⅡ酶切，插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经Pme Ⅰ酶切线性化后，转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经Pac I酶切后，转染293细胞包装成腺病毒颗粒，经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段，经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODC。转入pAdesy-l细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODC。转染293细胞进行包装，经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论：成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体，为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备

目的：构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体．方法：将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA（VEGF165）片段插入载体质粒pSNAV2．0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2．0-EGFP—U6-shRNA（VEGF165）．以HSV1-RapCap／△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒．对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测．结果：PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98％以上．点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×10^14v．g．（vector genomes）／L．EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30％以上．结论：成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础．     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的 构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体，探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性。方法 用DNA直接克隆连接的方法，构建反义Smad3腺病毒重组质粒，再用293细胞包装。重组腺病毒经扩增、纯化后，感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录。结果 经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功，RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达。结论 所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达，可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究。     

人正、反义转化生长因子beta1基因真核表达载体的构建

目的 :构建人转化生长因子beta 1(TGFβ1)正、反义基因真核表达载体。方法 :从人胎脑的cDNA文库中扩增出TGFβ1共 12 84bp长的DNA片段后 ,与T载体直接进行高效连接 ,并测序证实无突变。接着利用TGFβ1引物两端所设计的酶切位点将目的片段定向亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )。构建的正反义表达重组体 (pcDNA3.1 TGFβ1和pcDNA3.1 antiTGFβ1)经限制性内切酶消化证实其中有目的片段完整插入。结果 :本实验成功构建了人正、反义TGFβ1基因真核表达载体。结论 :人正、反义TGFβ1基因真核表达载体的构建 ,为今后研究腹膜纤维化的防治奠定了实验基础。     

血管内皮生长因子反义RNA抑制人喉鳞癌的生长

目的　观察血管内皮生长因子1 6 5反义 RNA对人喉鳞癌细胞 Hep- 2的作用 ,探讨其治疗喉癌的可行性 .方法　采用亚克隆技术 ,构建并鉴定反义 VEGF1 6 5真核表达载体 ;重组质粒转染人喉鳞癌细胞 Hep- 2后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,利用原位杂交、EL ISA、激光共聚焦、图像分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后 Hep- 2细胞的生物学性状和致瘤性的改变 .结果　构建的 VEGF1 6 5反义真核表达载体在 Hep- 2细胞中获得表达 ,转染后的细胞 VEGF1 6 5的表达下降 70 % ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和血管生成能力明显下降 ,实验组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为 (736± 2 6 2 ) ,(74 4 0± 335 )和 (772 0± 35 0 ) mm3(P<0 .0 1) ,微血管密度分别为 (9.6± 5 .4 ) ,(45 .5± 8.4 )和 (48.4± 7.6 ) mm- 2 (P<0 .0 1) .结论　 VEGF1 6 5反义 RNA能够显著减少喉癌细胞内 VEGF1 6 5的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,有望成为抗喉癌的新基因治疗手段 .     

携带hVEGF121-EGFP融合基因的腺病毒表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子121(HUMAN VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR121,HVEGF121)和增强型绿色荧光蛋白(ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN,EGFP)融合基因的腺病毒表达载体,观测其表达。方法以PUC18-HVEGF121质粒中的HVEGF121CDNA为模板,用PCR法扩增HVEGF121CDNA片段并去除其终止密码子,将此片段连接到含有EGFP CDNA的PEGFP-N1质粒中,再将融合基因HVEGF121-EGFP克隆到穿梭质粒PDC315中,与腺病毒质粒共同转染293细胞,构建重组腺病毒,并进行滴度测定。用重组腺病毒感染NIH3T3细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度,并用免疫组化法检测VEGF121在NIH3T3中的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为1.2×1010~2.7×1011PFU/ML。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光表达。免疫组化结果也证明VEGF121能在NIH3T3中的表达。结论构建的HVEGF121-EGFP腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗,并观察外源基因在体内的表达。     

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用

目的构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF165）真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用. 方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165 mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标. 结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强. 与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%). 瘤细胞接种裸鼠后33 d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351±638) mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建趋化因子受体CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组载体并获取重组腺病毒以用于抗HIV-1基因治疗的研究.方法:用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中分别扩增出趋化因子受体CCR5,CXCR45′端翻译起始区653bp和636bp的cDNA片段,将其反向插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV中,再与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌同源重组,卡那抗性培养基筛选阳性克隆;同源重组的载体用脂质体转染剂转染293细胞包装、扩增,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)以及PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒.结果:成功构建了CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体,并于293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒,其滴度为:7.2×1012PFU/mL.结论:CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒的构建为研究双靶位辅助受体反义RNA抗HIV-1的作用打下基础.