逆转录病毒介导Fcy∷Fur/5-FC基因治疗对脑胶质瘤杀伤作用的研究

目的:研究融合型自杀基因Fcy∷Fur联合5-FC对胶质瘤细胞株C6的杀伤效果。方法:扩增Fcy∷Fur基因并构建Fcy∷Fur基因重组逆转录病毒载体PLXSN-Fcy∷Fur;载体转染包装细胞PT67获得高滴度病毒再转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∷Fur转基因细胞的杀伤效应。结果:PCR法扩增出全长Fcy∷Fur基因,经测序证实序列正确;PLXSN-Fcy∷Fur滴度为3×106CFU/ml;RT-PCR检测显示Fcy∷Fur转基因阳性克隆的C6细胞有效表达目的基因的mRNA;应用5-FC后FCM法检测到显著的凋亡峰,MTT法检测细胞有明显的杀伤效应。结论:融合型自杀基因Fcy∷Fur联合5-FC可对胶质瘤细胞C6产生明显的杀伤作用。     

逆转录病毒介导Fcy::Fur/5-FC基因治疗对脑胶质瘤杀伤作用的研究

目的研究融合型自杀基因FcyFur联合5-FC对胶质瘤细胞株C6的杀伤效果.方法扩增FcyFur基因并构建FcvFur基因重组逆转录病毒载体PLXSN-FcvFur;载体转染包装细胞PT67获得高滴度病毒再转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;以MTT法和FCM法检测5-FC对FcyFur转基因细胞的杀伤效应.结果PCR法扩增出全长FcyFur基因,经测序证实序列正确;PLXSN-FcyFur滴度为3×106CFU/ml;RT-PCR检测显示FcyFur转基因阳性克隆的C6细胞有效表达目的基因的mRNA;应用5-FC后FCM法检测到显著的凋亡峰,MTT法检测细胞有明显的杀伤效应.结论融合型自杀基因FcyFur联合5-FC可对胶质瘤细胞C6产生明显的杀伤作用.     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体,拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板,采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因,并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出,按正确阅读框架克隆进pLXSN中,重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明,扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达;重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体,为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

融合型自杀基因系统Fcy：：Fur／5-FC对人肝癌细胞株HepG2体外杀伤作用的初步研究

目的研究融合型自杀基因Fcy：：Fur联合5-氟胞嘧啶（5-Fc）对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。方法应用脂质体介导法将Fcy：：Fur基因转染人人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选2周后行有限稀释法获得稳定表达Fcy：：Fur基因的单克隆细胞。5-Fc处理后,通过MTF法和AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法,检测Fcy：：Fur／5～FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的细胞增殖及凋亡的影响。结果MqT法检测显示稳定表达Fcy：：Fur基因的HepG2单克隆细胞经5-Fc处理后,在1、2、3、4、5天时对细胞的增殖有明显抑制作用。AnnexinV—FITC＋PI双标记染色法检测细胞凋亡率：1天为5．74％,2天为11．04％,3天为17．56％;PBS处理的细胞凋亡率：1天为3．67％,2天为3．68％,3天为4．42％,凋亡率无明显改变。结论Fcy：：Fur／5-FC自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的增殖有明显的抑制作用,并可促进肿瘤细胞凋亡。     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的研究融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-氟胞嘧啶（5-FC）对人卵巢癌细胞株（SKOV3）的杀伤作用。方法构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达。以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应。结果测序鉴定证实插入片段正确。细胞转染24h后,60%转染细胞发出绿色荧光。经G418筛选,RT-PCR和Westernblot法检测到Fcy∶∶Fur表达。加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰。结论融合型自杀基因Fcy∶∶Fur联合5-FC对人卵巢癌细胞SKOV3有明显的杀伤作用。     

融合型自杀基因Fcy::Fur/5-FC对人卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的 研究融合型自杀基因Fcy::Fur联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对人卵巢癌细胞株(SKOV3)的杀伤作用.方法 构建含有融合型自杀基因Fcy∶∶Fur的荧光真核表达质粒,转染SKOV3细胞,筛选稳定表达的细胞株,RT-PCR和Western blot检测Fcy∶∶Fur表达.以MTT法和FCM法检测5-FC对Fcy∶∶Fur转基因细胞的杀伤效应.结果 测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,60%转染细胞发出绿色荧光.经G418筛选,RT-PCR和Western blot法检测到Fey::Fur 表达.加入5-FC后,MTT法检测到明显杀伤效应,FCM法检测到显著凋亡峰.结论 融合型自杀基因Fey::Fur联合5-FC驿人卵巢癌细胞SKOV3有明显的刹伤作用.     

CD基因联合5-FC治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤的实验研究

目的　了解人卵巢癌裸鼠移植瘤经 CD基因联合 5 - FC治疗后的变化。方法　 10只荷瘤裸鼠随机分为实验组 (n=5 )和对照组 (n=5 )。实验组将整合有 CD基因的复制缺陷的腺病毒 0 .1m l〔1× 10 1 0 pfu(菌斑形成单位 ) /ml〕注入瘤体内 ,同时将 5 - FC按每次 4 0 0 mg/kg注入裸鼠腹腔内。对照组以生理盐水代替病毒液及 5 - FC溶液 ,以同体积、同样方法注入裸鼠体内。结束治疗后 2 4小时处死裸鼠。用流式细胞仪测定肿瘤中心及边缘部位细胞凋亡和细胞周期 ;用 CA 12 5标准试剂盒检测肿瘤组织及裸鼠血清 CA12 5值 ;HE染色观察肿瘤组织及肿大淋巴结的病理表现。结果　 1治疗前实验组与对照组肿瘤重量分别为 12 93± 342 m g和 12 6 7± 312 mg,治疗后分别为2 2 31± 6 4 0 mg和 2 92 5± 1195 m g,实验组瘤重量小于对照组。 2肿瘤病理类型为低分化浆液性乳头状囊腺癌。与对照组相比 ,实验组肿瘤组织内有较多的炎性细胞浸润及明显的纤维化。另外 ,对照组裸鼠有 2只 (2 /5 )发生肿瘤淋巴结转移 ,而实验组裸鼠未发生肿瘤淋巴结转移。 3实验组肿瘤细胞总的凋亡率为 11.96± 5 .6 9% ,高于对照组的凋亡率 (7.6 5± 5 .2 1% ) (P<0 .0 5 )。4实验组与对照组 G1 期及 S期细胞构成比均无统计学差异 (P>0 .0 5 ) ;实验组     

逆转录病毒上清液瘤内注射介导体内mdrl基因转移

目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内ｍｄｒｌ基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移ｍｄｒｌ基因,腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性,免疫组化检测肿瘤细胞Ｐ－ＧＰ的表达,ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤内ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的表达量。结果 携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性,高滴度病毒上清液可达到６０％细胞表达Ｐ－ＧＰ,是病毒原液基因转移率     

逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究

目的：为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统。方法：用脂质体方法将含有标志基因 Ｎｅｏ Ｒ的逆转录病毒载体 Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 导入包装细胞 Ｐ Ａ３１７ ;通过与单向型包装细胞 Ｇ Ｐ Ｅ８６ 相互转导,获得高滴度的双嗜型产病毒细胞,并以其对人类白血病细胞进行基因标记。结果：脂质体转染法获得的病毒滴度约为２ ．０ ×１０５ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ,而与 Ｇ Ｐ＋ Ｅ８６ 细胞转导后可提高至２ ．８ ×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ;重组病毒转导白血病细胞（ Ｈ Ｌ－ ６０ , Ｋ５６２ , Ｋ Ｇ－ １） 后,聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 证实 Ｎｅｏ Ｒ 基因整合到靶细胞基因组,巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 与补救分析均未能检测到辅助病毒。结论：“乒乓效应”可显著提高逆转录病毒滴度,而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的。     

逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶｔｋ）基因导人恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷（ＧＣＶ）可选择性地杀死肿瘤细胞．本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并切除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞，４８ｈ后，在光镜下观察细胞形态及进行活细胞计数．结果表明，ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

脑胶质瘤基因治疗中丙氧鸟苷对细胞系的毒性分析

目的 :研究丙氧鸟苷 ( GCV)对 C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞、psi2 STK细胞的毒性。方法 :将 C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞、psi2 STK细胞分别在不同浓度 GCV的培养基中培养 ,观察以上 3类细胞对 GCV的毒性反应。结果 :在有效浓度 ( 0 .0 1～ 1 0 μmol·L-1 )中 ,GCV对C6BPBAG脑胶质瘤细胞、psi2细胞几乎无伤害 ,而经改造后的 psi2 STK细胞对 GCV毒性明显提高。结论 :通过体外实验证实由逆转录病毒载体 ( STK)传导的 HSV- TK基因 ,在培养的 C6胶质瘤细胞中 ,可提高 GCV对 psi2 STK细胞的敏感性     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

重组融合蛋白Ph-PA对绿脓杆菌体内体外抗菌活性的初步研究

目的制备和纯化抗绿脓杆菌工程多肽Ph-PA,并检测其对绿脓杆菌的体内外抗菌活性。方法经离子交换柱纯化收集Ph-PA后,通过体外抗菌试验和体内感染保护试验并与现有抗生素对比,检测其抗菌活性。结果体内外抗菌实验结果显示Ph-PA对绿脓杆菌有较强的抗菌作用,且表现出相对的靶向特异性,对绿脓杆菌ATCC 27853的最小抑菌浓度（MIC）为4μg／mL。按照相同相对分子质量进行标化后比较,Ph-PA的抗菌活性至少是哌拉西林的2200倍,头孢他啶的220倍。结论Ph-PA在体外及体内对绿脓杆菌都表现出较强的抗菌活性,为治疗绿脓杆菌感染提供了新的思路,具有临床应用潜力。     

重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc),并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类风湿关节炎基因治疗的可行性.方法首先以RT-PCR分别从大鼠脾细胞和大鼠淋巴细胞总RNA中扩增出大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAVⅠ载体质粒进行重组病毒生产.在获得重组病毒后于Lewis大鼠肌肉注射,于不同时间ELISA测定血清ratTNFR:Fc表达,并以TNF-α细胞毒中和实验测定重组病毒表达产物的生物学活性.结果所构建的重组病毒rAAVⅠ/ratTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒于Lewis大鼠肌肉注射后可表达ratTNFR:Fc蛋白,含有ratTNFR:Fc蛋白的血清可以有效中和大鼠TNF-α对L929细胞的杀伤作用.结论本研究所构建的携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)可以用来作为阻断TNF-α的手段于大鼠类风湿关节炎模型上进行基因治疗研究.     

Inhibition of BCNU-Resistance in Glioma Cell Lines by Small Interfering Rna Targeting to Interleukin-8 Gene

It had been found that interleukin-8 （IL-8） was associated with drug resistance. We previously demonstrated that the resistance to 1, 3-bis （2-chloroethyl）-1-nitrosourea （BCNU） of glioma cell line SWOZI was much higher than that of cell line SOWZ2, which were both cloned from the same parental glioma cell line SWO38. In this study, IL-8 was found to be upregulated both in SWOZ1 and SWOZ2-BCNU, a BCNU-resistant glioma cell line. To further investigate the function of IL-8, the BCNU-resistant cell lines SWOZ1 and SWOZ2-BCNU were treated with siRNAs targeting IL-8. The results of quantitative RT-PCR showed that a decreased level of IL-8 mRNA expression in SWOZI and SWOZ2-BCNU for more than 90% compared to negative control and was confirmed by western blot assay （P 〈 0.05） after treated by siRNAs targeting IL-8. Subsequently, the cytotoxicity of BCNU to these cell lines was detected using the cell counting kit-8 assay. As a result, the BCNU resistance was reversed for about 50% both in these two cell lines （P 〈 0.05）. Our data demonstrated that inhibition of IL-8 with specific siRNAs can reverse the BCNU resistant phenotype in glioma cell lines, indicating that IL-8 may play an important role in BCNU-resistance in glioma.     

实时定量PCR检测Bcl-2/IgH融合基因在淋巴瘤中的应用

Bcl-2/IgH融合基因是淋巴瘤的肿瘤特异性标志,见于85%～90%的滤泡性淋巴瘤及30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。大量研究表明,该融合基因与滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤有很好的相关性,对Bcl-2/IgH的定量检测能反应淋巴瘤的临床进程。现就实时定量PCR技术对Bcl-2/IgH融合基因的检测在淋巴瘤的分期、疗效评价、预测复发和预后评估等方面的临床意义进行综述。     

双标记原位杂交法检测间期细胞BCR/ABL融合基因

目的 :应用双标记原位杂交方法检测 BCR/ ABL融合基因。方法 :BCR基因探针用地高辛标记 ,碱性磷酸酶显色 ;ABL基因用3 H- d ATP标记 ,核子乳胶放射自显影。结果 :检测 9例初治的慢性粒细胞白血病 ( CML)病人均为阳性 ,阳性细胞比例为 93% ;检测 CML来源的 K5 62细胞株阳性细胞占 98.8% ;正常人假阳性率为 0 .75 %。结论 :该方法简便、快速 ,适用于 CML微小残留病的检测