RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的:研究RASSF1A提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用。方法:通过脂质体介导的基因转染法将RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY-7703,G418筛选稳定表达株,并以RT-PCR和Western Blot进行鉴定目的基因的表达。化疗药物阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)分别作用各细胞株后,检测各细胞株的生长抑制率。结果:经800μg/ml的G418最佳筛选浓度筛选QGY-7703细胞株,成功建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。以QGY-7703细胞为对照,MMC对表达RASSF1A基因的肝癌细胞的生长抑制率最大为21%。结论:RASSF1A基因的表达可明显提高肝癌细胞对MMC的敏感性。RASSF1A的表达不影响肝癌细胞QGY-7703对ADM、VP-16、5-FU和DDP敏感性。     

野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的：探讨转染外源野生型p53基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。并了解p53基因与HeLa细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导，将含人野生型p53cDNA的cCB6.p53质粒导入人宫颈癌HeLa细胞株中，筛选阳性克隆，用免疫组化ABC法检测p53基因的表达情况，加入顺铂72小时后，用四唑盐比色试验检测存活的HeLa细胞数。结果：在G418选择培养基中培养两周后，成功地生长出阳性细胞克隆，免疫组化法证实外源性p53基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代，p53基因转染对HeLa细胞的生长有明显的抑制作用。p53表达阳性的HeLa细胞对顺铂的敏感性明显增加，结论：野生型p53基因转染能使HeLa细胞出现生长抑制和化疗敏感性增强。     

膀胱移行细胞癌中RASSF1A基因的表达及其临床意义

目的研究RASSF1A基因在膀胱移行细胞癌(TCC)中的表达及其临床意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应检测45例膀胱TCC及其相应癌周正常组织中RASSF1A基因mRNA表达情况,采用免疫组织化学方法检测38例膀胱TCC及18例癌周正常组织中RASSFIA蛋白表达情况。结果与癌周正常组织相比,60.0%(27/45例)的膀胱TCC组织中发现RASSF1A mRNA表达异常下调。RASSF1A蛋白在膀胱TCC组织中的阳性表达率为36.8%,明显低于癌周正常组织中的83.3%(P<0.05)。不同临床分期和病理分级间RASSF1A mRNA表达异常和RASSF1A蛋白阳性表达的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论RASSF1A的失表达可能参与膀胱TCC的发生。     

RASSFIA基因启动子甲基化与乳腺癌相关性研究

目的:研究抑癌基因RASSF1A在乳癌组织中的表达情况及与RASSF1A基因启动子甲基化的关系。方法:运用RT-PCR方法检测40例乳癌组织和6例乳腺良性肿瘤和5例正常乳腺组织中RASSF1A的表达,运用甲基化特异PCR方法检测这些组织中RASSF1A基因启动子的甲基化情况。结果:RASSF1A基因在40例乳腺癌组织中8例(20%)存在表达缺失,差异无统计学意义(P>0.05)。但其表达量明显低于正常乳腺组织(P<0.05)。乳腺癌组织的RASSF1A基因启动子甲基化频率(65%)明显高于正常乳腺组织(20%)和乳腺良性肿瘤(17%)(P<0.05)。结论:乳腺癌组织中RASSF1A基因启动子的高甲基化是引起RASSF1A基因表达下调的重要原因,在肿瘤的发生和发展中起重要的调控作用。     

野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察

目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响。方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化。结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P<0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P<0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P<0.05)。结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应。     

莱菔硫烷对胃癌细胞SGC-7901 RASSFIA甲基化及表达的影响

目的探讨莱菔硫烷（SEN）对胃癌细胞SGC-7901RASSF1A甲基化及表达有何影响。方法体外培养胃癌细胞SGC-7901细胞,用0,10μM,30μM,50μM的SFN与SCG-7901细胞孵育24～96h,采用甲基化特意性PCR检测RASSFIA基因启动子区域的甲基化改变情况;提取EGCG处理后SGC-7901细胞的RNA,用逆转录PCR检测RASSF1A的表达水平。结果静息状态下,SCG-7901细胞可检测出RASSF1A基因启动子区域有明显的甲基化条带,当与50μMSFN孵育96h后,甲基化水平有所减弱,而非甲基化基因增多。SFN也能以剂量依赖性与时间依赖性方式促进SGC-7901细胞RASSFIA基因mRNA的表达。结论SFN能使RASSF1A基因去甲基化,并上调非甲基化基因的表达水平,这可能是其抗肿瘤的重要机制。     

斑蝥酸钠对人肝癌细胞HepG2的增殖作用及血管内皮生长因子表达的影响

目的研究斑蝥酸钠对人肝癌细胞的增殖作用及其对血管内皮生长因子(VEGF)的表达的影响,探讨斑蝥酸钠抗肿瘤的作用机制。方法体外培养人肝癌细胞株(HepG2),用不同浓度的斑蝥酸钠作用于肝癌细胞,采用MTT法观察不同浓度和作用时间下斑蝥酸钠对细胞增殖的影响,采用免疫组化法检测血管内皮生长因子的表达情况。结果在一定浓度范围内斑蝥酸钠对肝癌细胞有明显增殖抑制作用,且降低了VEGF的分泌水平,并呈时间-剂量依赖关系。结论斑蝥酸钠对肝癌细胞的增殖有抑制作用,且减低了细胞内血管内皮生长因子蛋白的表达,表明斑蝥酸钠在抑制肝癌生长的作用机制之一是通过抑制肿瘤血管生成发挥作用的。     

Mutant p27(Kip1) and its potential effect as hepatocellular gene therapy

BACKGROUND: The cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor p27(Kip1) is an important regulator of cell cycle progression as it negatively regulates G(0/1) progression and plays a major role in controlling the cell cycle. The screening of the p27(Kip1) sequence identified many potential phosphorylation sites. To investigate the effects of the overexpression of exogenous p27(Kip1) protein lacking the Thr157 sites on subcellular localization, cell cycle, and proliferation, a plasmid was constructed containing mutations of p27(Kip1) at Thr157 (T157A p27), and transfected into the SMMC7721 cell line with Lipofectamine. Wild-type and mutant p27 plasmids T157A were transfected separately as control groups. METHODS: We detected the proliferation of SMMC7721 cells by the Cell Counting Kit and FACS/Calibur Flow Cytometer and analyzed the expression and localization of p27(Kip1) by Western blotting analysis and cell fractionation. The cdk2 dependent kinase activity was determined by in vitro kinase assay. RESULTS: Proliferation of SMMC7721 cells was greatly inhibited and cell cycle was arrested in G(0/1) phase after exogenous p27(Kip1) mutant expression much more than wild-type p27(Kip1). The expressed T157A p27(Kip1) proteins were translocated from the cytoplasm into nucleus much more compare with wild-type. Compared with pcDNA3.1-Myc control, transient transfection of T157A p27(Kip1) decreased expression of cyclin D1 and the phosphorylated form of retinoblastoma protein. CONCLUSIONS: These findings support the potential effectiveness of a PI3K/Akt-resistant phosphorylated form of p27 in hepatocellular carcinoma gene therapy.     

TRAIL蛋白联合吉西他宾对肝癌细胞的体外杀伤作用

目的研究肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体（TRAIL）和吉西他宾对肝癌细胞的杀伤作用及联合作用。方法将生长良好的肝癌细胞接种于96孔板,培养24h后,加入不同浓度TRAIL和吉西他宾,倒置显微镜下观察细胞形态变化;利用非同位素细胞增殖试剂盒和流式细胞仪分别检测细胞的生长抑制率和细胞凋亡。结果（1）TRAIL组、吉西他宾组、TRAIL和吉西他宾联合用药组24h后肝癌细胞几乎全部从培养瓶壁脱落;（2）TRAIL与吉西他宾对10株肝癌细胞均有不同程度的生长抑制作用。其中ch—hep-2对TRAIL及吉西他宾最敏感,其IC50分别为24．33ng／ml和328mg／ml;当TRAIL蛋白浓度为500ng／ml时,吉西他宾对ch—hep-2的生长抑制作用明显增强,IC50为065mg／ml,其细胞毒作用增强5倍,流式细胞仪检测两者作用后的细胞,均可检测到细胞调亡峰。结论TRAIL和吉西他宾协同诱导肝癌细胞发生调亡,TRAIL蛋白可明显增加吉西他宾的杀伤效应,它可作为临床肝癌化疗的辅助药物。     

Bcl—2和p53蛋白表达对肝硬变和肝细胞癌中细胞增殖和凋亡的 …

利用原位ＤＮＡ末端转移酶标记技术及Ｓ 疫组织化学方法检测了肝硬变和肝细胞癌（ＨＣＣ）组织中凋亡细胞,ｐ５３,ｂｃｌ－２蛋白和ＰＣＮＡ的表达。结果显示：ＨＣＣ与肝硬变组织比较,凋亡细胞密度低,ＰＣＮＡ阳性细胞密度高ｐ５３和ｂｃｌ－２蛋白阳性强度高,且均与ＨＣＣ分化程序有关。提示ｐ５３和ｂｃｌ－２蛋白可能是通过其过度表达影响细胞增殖和细胞凋亡失衡,并以“选择性细胞增殖”形式导致的发生和发展。     

靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性

目的:利用已构建好的在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体AdAFP-p16,研究腺病毒介导p16基因的表达对肝癌裸鼠移植瘤的抗癌活性.方法:培养肝癌细胞SMMC-7721,于裸鼠右侧腹部近腋下皮肤注射1×106细胞数细胞悬液,建立裸鼠肝癌移植瘤模型.成瘤后给于瘤体内AdAFP-p16病毒注射治疗,病毒总量1×109 pfu/只,观察AdAFP-p16对肝癌模型的抗肿瘤疗效以及p16基因表达引起的肝癌细胞病理变化.结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,具有明显的肿瘤生长抑制作用,抑制率可达60.12%(P＜0.01),引起肝癌细胞的坏死.结论:AFP启动子控制的p16基因在肝癌细胞中定向表达,能够抑制肝癌模型的生长,对肝癌综合治疗具有重要意义.     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长抑制作用的研究

目的观察RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长的抑制。方法将包含RASSF1A基因的质粒转染RASSF1A表达缺失的EC9706细胞,建立稳定转染细胞系,通过MTT法检测细胞活性和增殖能力、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响、裸鼠移植瘤实验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果稳定表达RASSF1A的EC9706细胞较对照组细胞的RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度减慢（P〈0．01）;细胞周期中G1期比例增加,S期比例减少（G1期：RASSF1A组细胞：68．53％±3．34％;空质粒组：54．25％±4．61％;未转染组：53．41％±5．60％。S期：RASSF1A组细胞：（23．19±5．04）％;空质粒组：（31．81±2．05）％;未转染组：32．09％±1．99％）（P〈0．01）;同时裸鼠致瘤能力也被抑制（P〈0．05）。结论RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,提示该基因在食管癌的发生发展中发挥重要作用。     

奥沙利铂抗人肝癌细胞株QGY增殖及其机制的研究

目的观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人肝癌细胞株QGY体外增殖的影响并探讨其机制,为其能否应用于肝癌的临床治疗提供理论依据.方法采用人肝癌细胞株QGY作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制效应;光镜及透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果奥沙利铂对QGY细胞的增殖均有抑制作用而且呈时间和剂量依赖性.光镜观察发现细胞体积缩小,变圆,胞浆浓缩,核固缩深染,呈现凋亡早期的形态学改变.电镜可见凋亡细胞及凋亡小体.流式细胞仪检测到细胞阻滞于细胞周期的S期和G2/M期,G0/G1期细胞减少及凋亡峰.奥沙利铂作用72 h后,免疫细胞化学表明cyclin A、Bax表达增强,突变型P53蛋白(MTP53)、Bcl-2、Myc表达减弱,Fas表达无差异.结论奥沙利铂对QGY肝癌细胞的增殖都有一定的抑制作用,阻滞细胞周期于S期及G2/M期,它通过上调Bax的表达,下调MTP53、Bcl-2、Myc的表达而诱导细胞凋亡,该药可能不是通过Fas途径诱导细胞凋亡.     

抑癌基因RASSF1A在肝癌中表达的研究

目的研究抑癌基因RASSF1A在肝癌组织以及肝癌细胞株中的表达情况及其与临床相关因素间的关系。方法收集24例手术切除的肝癌及其癌旁组织以及4株肝癌细咆株（SMMC7721、HepG2、BEL7402和BEL7703（由国家人类基因组南方中心提供）。用RT-PCR和Northern Blot的方法来分析基因RASSF1A在肝癌组织和肝癌细胞株中的表达情况。结果67％的原发性肝癌组织中未检测到RASSF1A的mRNA，而相应的癌旁组织中仅33％的样本未表达RASSF1A；75％（3／4）肝癌细胞株也未表达RASSF1A。结论RASSF1A在肝癌中是一潜在的抑癌基因．RASSF1A基因的失表达在原发性肝癌的发生发展中起重要作用，检测RASSF1A的表达情况可用于对肝癌的早期发现和早期诊断，结合临床相关因素对肝癌预后评估也有帮助。     

MCP-1在乳腺恶性肿瘤细胞增殖与转移中的作用

目的 探讨人单核细胞趋化因子-1(MCP-1)在乳腺恶性肿瘤细胞增殖转移中的作用.方法 构建MCP-1过表达的稳转人乳腺癌细胞MCF-7细胞和空载MCF-7细胞,分别标记为MCP-1过表达MCF-7细胞(MCP-MCF-7)、空载MCF-7细胞(EV-MCF-7).通过CCK8细胞增殖实验、单克隆形成实验、划痕实验和细胞凋亡检测,观察MCP-1过表达对细胞增殖转移及凋亡的影响.通过real-time PCR法检测MCP-1可能的下游基因.结果 成功构建了MCP-1过表达MCF-7乳腺癌细胞株及对照细胞株.CCK8实验显示培养第5天起MCP-MCF-7细胞株在450 nm处的吸光度明显高于EV-MCF-7组,且差异有统计学意义(P<0.05).细胞集落形成实验提示MCP-MCF-7细胞株所形成的集落数量明显多于EV-MCF-7细胞,差异有统计学意义(P<0.05),且前者单个集落的体积亦大于后者.划痕实验中12 h后MCP-MCF-7细胞的迁移能力开始增强,到48 h时划痕更加愈合明显.虽然转染MCP-1后细胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空载细胞(1.10%),但差异无统计学意义(P>0.05),即MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞凋亡无影响.在对MCP-1下游可能基因的分析结果提示MCP-1可以上调p65、MMP2、STAT2基因表达,下调RASSF1基因表达.结论 MCP-1具有直接促进乳腺恶性肿瘤细胞的增殖和转移能力,且此种作用可能与p65、MMP2、STAT2、RASSF1有关.     

顺铂诱导人肝癌细胞凋亡模型的构建

目的 建立肝癌细胞凋亡模型,探讨顺铂抗癌作用机理,为进一步研究细胞凋亡分子机制打下基础。方法 用抗癌药顺铂诱导增减的人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１肝癌细胞发生凋亡,用四氮甲唑蓝比色试验（ＭＴＴ）,细胞形态学检查,ＤＮＡ凝胶电泳检测。结果 顺铂可显著抑制ＳＭＭＣ－７７２１细胞的生长,并有很好的量效和时效关系,经药物作用后,肝癌细胞在显微镜下呈现典型的凋亡形态学改变,ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳吴现明显的梯度     

In vitro chemosensitivity of hepatocellular carcinoma for hepatic arterial infusion chemotherapy using the MTT assay with the combinations of antitumor drugs

Despite the hepatic arterial infusion chemotherapy (HAI) has been advocated as an effective therapy for hepatocellular carcinoma (HCC) with multiple intrahepatic metastases, chemosensitivity of HCC for HAI with multidrug regimen has not been sufficiently investigated. The purpose of this study was to evaluate the in vitro chemosensitivity of HCC using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay with the combinations of various antitumor drugs, and compared with the clinical results of HAI for patients with multiple intrahepatic recurrences of HCC. To evaluate the in vitro chemosensitivity of HCC to the combinations of antitumor drugs, 54 resected specimens of HCC were assayed using MTT assay with seven antitumor agents, 5-fluorouracil (5-FU), mitomycin C (MMC), adriamycin (ADM), etoposide (VP-16), cisplatin (CDDP), methotrexate (MTX) and CPT-11 (SN-38), exposed singly, or in combination. The data were compared with the clinical results of HAI for patients who manifested the multiple intrahepatic recurrence. In addition, the in vitro combined effect of CDDP and 5-FU for human hepatocellular carcinoma cell, KYN-1 and KYN-2, was analysed quantitatively. Of 54 resected specimens, 40 specimens assayed successfully, and an increased in vitro chemosensitivity of HCC when treated with combinations of antitumor drugs was observed: single drug 12.2%, two drugs combined 50.9% and three drugs combined 67.0%. The results of in vitro assay were well correlated, 85.7% in predicting accuracy, with the clinical results of 14 patients who underwent HAI for multiple recurrence of HCC, and also correlated with the experimental results of the combined use of CDDP and 5-FU in KYN-1 and KYN-2 in terms of pharmacokinetic reactions, i.e. synergism or antagonism. The MTT assay with the combinations of antitumor drugs represents an informative chemosensitivity test to HAI with multidrug regimen for recurrence of HCC.     

硒蛋氨酸对肝癌细胞株SMMC7402凋亡的诱导作用

目的:研究硒蛋氨酸对肝癌细胞株SMMC7402生长的影响及其作用机制。方法:采用MTT比色法、流式细胞术、DNA片段分析法,研究硒蛋氨酸对肝癌SMMC7402细胞生长、增殖及凋亡的影响。结果:硒蛋氨酸呈时间-剂量依赖性方式抑制SMMC7402细胞生长增殖;G1期前出现亚倍体凋亡峰,细胞阻滞于G0/G1期;DNA电泳出现特征性凋亡梯带。结论:硒蛋氨酸可抑制肝癌细胞株SMMC7402的生长增殖,诱导细胞凋亡。     

5-Aza-CdR对人肝癌细胞RASSF1 A甲基化的影响

目的：探讨5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肝癌细胞RASSF1A基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,分别用0.5、5.0、30.0、50.0μmol/L的5-Aza-CdR与之孵育72 h,甲基化PCR检测处理前后启动子甲基化水平,RT-PCR检测RASSF1A mRNA表达。结果随着药物浓度的增加,甲基化RASSF1A含量逐渐降低,而未甲基化产物逐渐增高;5-Aza-CdR处理后,RASSF1A mRNA的含量随之增高。结论5-Aza-CdR可逆转SMMC-7721细胞株细胞中基因甲基化修饰状态。