大鼠缝隙连接蛋白Connexin 43的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建缝隙连接蛋白connexin 43(CX43)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行基因治疗研究奠定基础。方法:合成CX43发夹样shRNA的DNA单链一对和对照单链scramble一对,退火后将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的穿梭质粒pAd shRNA/H1,得到pAd shRNA/H1-CX43和pAd shRNA/H1-scramble。分别酶切及DNA测序鉴定后,经Pme I线性化后转化入BJ5187-AD-1感受态细菌,在细菌内进行同源重组构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体。用Pac I酶切鉴定重组菌。将Pac I酶切重组的两种腺病毒质粒载体后,经脂质体转化293细胞进行包装得到重组的腺病毒颗粒,并通过293细胞绿色荧光表达反应重组腺病毒表达情况。将重组的腺病毒Ad-Cx43 shRNA和对照病毒Ad-scramble shRNA分别感染大鼠原代培养的星形胶质细胞,并检测星形胶质细胞CX43的表达。结果:证实穿梭质粒的以及重组腺病毒质粒均构建正确,腺病毒质粒转染293细胞后48 h即可见绿色荧光蛋白表达,10 d后全部细胞表达绿色荧光,并有半数细胞飘起,收获病毒感染培养星形胶质细胞后48 h,均有绿色荧光表达,经感染Ad-Cx43 shRNA的星形胶质细胞CX43的表达明显低于感染对照病毒Ad-scramble shRNA的星形胶质细胞。结论:成功构建表达大鼠CX43特异性发夹状shRNA的重组腺病毒载体,将为应用基因沉默技术研究CX43在神经系统疾病尤其是缺血性脑损伤中的作用提供依据。     

大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率

背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法。同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点。体外连接法又不可避免非特异性的基因重组及基因突变。目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率。设计、时间及地点:单一样本实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光报告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛基因组研究中心有限公司。方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒;用KpnⅠ XhoⅠ从质粒pCMV-Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1基因片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒。用I-CeuI I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒。将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞。主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率。结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以KpnⅠ XhoⅠ双酶切可回收3kb的克隆片段和5.1kb的载体片段;重组腺病毒质粒用XhoⅠ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段。②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13kb的特异性片段;用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011PFU/mL。③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24h后所有细胞均表达绿色荧光。结论:成功构建了携带大鼠黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞。     

SIK2 shRNA重组腺病毒载体构建及其在3T3-L1脂肪细胞的表达

目的构建特异性小鼠盐诱导基因（Salt induced kinase2,SIK2）的shRNA腺病毒载体,干扰脂肪细胞中SIK2的表达。方法设计3对靶向SIK2的shRNA,插入穿梭质粒pENTR/U6载体,转染3T3-L1脂肪细胞,通过Real-timePCR方法筛选最佳沉默SIK2效果的穿梭质粒,经腺病毒同源重组后,重组小鼠SIK2shRNA腺病毒载体经脂质体转染HEK293A细胞,在细胞内包装获得腺病毒颗粒AdV-SIK2-shRNA,并进行大量扩增和纯化。纯化的腺病毒感染成熟的3T3-L1脂肪细胞,通过Real-time PCR及免疫印迹法检测鼠SIK2在3T3-L1脂肪细胞中的表达水平。结果纯化后的Ad-shRNA-SIK2重组腺病毒载体可特异下调成熟3T3-L1脂肪细胞SIK2 mRNA和SIK2蛋白的表达。结论干扰3T3-L1脂肪细胞SIK2表达的短发夹RNA重组腺病毒载体构建成功。     

EEF1A2嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人类真核翻译延长因子1A2(EEF1A2)基因全长,构建其重组腺病毒载体。方法:应用RT-PCR方法从人胰腺癌组织中扩增人EEF1A2基因全长,经T-A克隆后,亚克隆到腺病毒穿梭质粒pDC316,构建穿梭质粒pDC316-EEF1A2。利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-EEF1A2共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2,经过在293细胞中包装和扩增之后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-EEF1A2。PCR、WesternBlot检测EEF1A2基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从人胰腺癌组织中扩增出1400bp的cDNA片段,经测序证实为人EEF1A2基因。构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-EEF1A2。结论:成功地克隆了人EEF1A2基因全长,并构建其表达的重组腺病毒载体,为进一步研究人EEF1A2基因在相关疾病中的作用奠定了基础。     

重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP的构建与鉴定

目的:转录因子Olig1调控了少突胶质前体细胞的分化和成熟,并参与了脱髓鞘损伤后的修复,是治疗脱髓鞘疾病的候选基因,在缺血性脑血管病的治疗中具有极大的应用价值。本实验旨在构建携带Olig1基因的重组腺病毒载体。方法:pDC315-Olig1为模板,聚合酶链反应扩增酶切Olig1片段,连接到带有eGFP标记基因的载体质粒pDC315-eGFP上,构建穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP,经PCR,酶切及测序鉴定后,利用AdMax包装系统,通过脂质体2000的介导与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组后产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,应用PCR对毒种进行鉴定,传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:经聚合酶链反应,酶切鉴定和测序分析,得到大小700bp(Olig1)目的片段,证实正确构建重组穿梭质粒pDC315-Olig1-eGFP和重组腺病毒Ad5-Olig1-eGFP,测得重组腺病毒颗粒数为2.3×1011v.p./mL。结论:成功构建携带Olig1的重组腺病毒载体Ad5-Olig1-eGFP,为缺血性脑血管病的基因治疗提供基因载体并奠定实验基础。     

携带HIV-1vpr基因的重组腺病毒的构建与鉴定

目的　构建携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法　利用AdEasy 1系统 ,通过含有目的基因片段vpr的穿梭载体pShuttle CMV/vpr和骨架质粒pAdEasy 1在细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒pAdCMV/vpr。将重组质粒转染 2 93细胞包装出重组腺病毒rvAdCMV/vpr。利用PCR等方法对重组腺病毒进行鉴定。结果　获得表达vpr蛋白的重组腺病毒。结论　成功构建出携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为更深入的基因治疗研究奠定了基础。     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景:腺病毒载体作为低毒高效的基因载体己被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见.目的:构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法:采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度.结果与结论:观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验己成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体.     

腺病毒递送BMI-1shRNA

近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs。虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点,但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用。本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi—1的载体。以pAdTrackCMV质粒为模板扩增CMV—GFP表达盒,从pGE1BMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd—BMIhRNA—CVM—GFP,转染293A包装细胞,收获病毒。病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用RealTime—PCR和Western blot检测BMI的表达水平。结果表明：成功构建了pGE1BMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒。感染BmmRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而对照病毒没有明显的效果。结论：腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体。腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体。     

BMI-1干扰基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

背景：BMI—1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的。目的：以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体，制备重组腺病毒pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2／P3P4。设计、时间及地点：开放性实验，于2006-02，2007-08在江苏大学医学技术研究所完成。材料：限制性内切酶由NewEnglandBioLabs提供，腺病毒骨架质粒pAdEasy—1、大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠。方法：采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle—H1，PmeI线性化质粒，通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy—1，得到重组的腺病毒干扰质粒；经PacI线性化后用脂质体转染方法转染293A细胞，收获腺病毒重组病毒子，以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照，包装后收集细胞，反复裂解细胞获得腺病毒。主要观察指标：腺病毒质粒重组构建及鉴定情况。结果：经酶切鉴定，已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2/P3P4，获得了重组病毒子。结论：利用新型腺病毒载体pAdeasy—1系统可在短期内制备BMI—1干扰基因的腺病毒表达载体，并制备出重组腺病毒P1P2/P3P4。     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究

目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载体病毒组(转染不含shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)、干扰载体病毒组(转染shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,利用RT-PCR和Western-Blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、巢蛋白的表达。结果:CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%;CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。慢病毒转染效率为90%以上。空白对照组、空载体病毒组和干扰载体病毒组的GFAP、NSE、NF和巢蛋白m RNA的相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中空载体病毒组和空白对照组的比较差异无统计学意义(P>0.05),干扰载体病毒组和空载体病毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论:慢病毒介导shRNA LINGO-1干扰载体转染促进BMSCs可提高BMSCs向神经细胞转化的效率。     

LINGO-1 antagonists as therapy for multiple sclerosis: in vitro and in vivo evidence

Background: Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disease of the CNS that causes progressive neurological disability in most patients. Certain alleles of immunity-associated genes increase risk of MS, confirming a role for autoimmune mechanisms in pathogenesis. Activated mononuclear cells infiltrate the CNS and trigger an inflammatory cascade, resulting in demyelination and axonal injury. Non-inflammatory mechanisms also appear to be involved in axonal degeneration but are not fully elucidated. Current therapies are anti-inflammatory, and no available therapy is known to promote myelin repair or maintenance. Leucine-rich repeats and Ig domain-containing, neurite outgrowth inhibitor (Nogo) receptor–interacting protein-1 (LINGO-1) is a potent negative regulator of axonal myelination. Objective/methods : This article provides an overview of the available data on the effects of LINGO-1 antagonists on oligodendrocyte differentiation and remyelination. Results/conclusion: LINGO-1 is a potential target for neuroprotective therapy in that antagonists may promote remyelination in diseases such as MS.     

急性一氧化碳中毒后大鼠脑白质中LINGO-1的动态表达变化

目的：观察LINGO-1在急性一氧化碳（CO）中毒后大鼠脑白质中的动态表达变化。方法：选择70只SD雄性大鼠随机分为对照组,染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d组（n-10）。采用甲苯胺蓝染色观察染毒后各时间点大鼠脑白质髓鞘脱失情况,并应用免疫组织化学染色及实时定量RT-PCR的方法观察LINGO-1的表达变化。结果：①对照组LINGO-1表达极低,染毒后1d,LINGO-1mRNA和蛋白表达上调均最为显著,3d时下降接近至对照组水平,在7d时均再次出现上调至21d开始下降,28d时LINGO-1mRNA接近对照组水平,而LINGO-1蛋白略高于对照组。②对照组无脑白质脱髓鞘出现,染毒后7d观察到脑白质轴突髓鞘脱失,直至28d脱髓鞘现象仍在发生。结论：在大鼠发生急性CO中毒后,其脑白质中的LNGO-l即发生上调,并呈现二次上调的规律性改变,且二次上调与脑白质脱髓鞘病变发生时间相关联,提示其与CO中毒后脑白质脱髓鞘病变相关。     

运动训练对脑出血大鼠LINGO-1表达的影响

目的 探讨运动训练对脑出血大鼠神经功能恢复和脑内LINGO-1表达的影响。 方法 选取72只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和运动训练组,每组24只,各组再按观察时间的不同随机分为1、3、7和14d四个时间点,每个时间点6只大鼠。制备脑出血模型,运动训练组采用跑台跑步法进行跑步运动训练。各组大鼠采用Longa评分法评价神经功能缺损程度,RT-PCR法检测LINGO-1 mRNA的表达,Western blot法检测LINGO-1蛋白的表达。 结果 假手术组神经功能损伤轻,Longa评分0或1分,各时间点LINGO-1 mRNA和蛋白表达均仅少量表达。模型组Longa评分7d最高达3分,14d出现下降到2分;LONG-1 mRNA 3d表达最高达0.737±0.041,7d出现下降为0.429±0.035;LONG-1蛋白7d到高峰达1.335±0.393,14d出现下降为1.225±0.424。运动训练组在14d Longa评分为1分,较模型组下降（P<0.05）;在7d和14d LINGO-1 mRNA表达分别为0.257±0.042和0.137±0.035,较模型组下降（P<0.05）;在14d LINGO-1蛋白表达为0.663±0.276,较模型组下降（P<0.05）;且各时间点LINGO-1蛋白的表达与Longa评分成正相关（r1d=0.837,P1d=0.036;r3d=0.845,P3d=0.047;r7d=0.891,P7d=0.029;r14d=0.926,P14d=0.018）。 结论 运动训练可下调LINGO-1 mRNA和蛋白的表达,促进脑出血后神经功能恢复。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段.方法 根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cbshRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22α p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22α e/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3 cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）;将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72 h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量.结果 荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少（P＜0.05）;酶切鉴定重组质粒载体SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22α e/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22α e/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达.     

MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MYCT-1(myc target)基因真核表达载体,观察其转染胃粘膜GES-1细胞系后的表达。方法用RT-PCR法合成MYCT-1 cDNA,克隆至表达载体pcDNA3.1上,测序验证无突变发生。将表达载体转染GES-1细胞,用RT-PCR和Western blot检测MYCT-1基因的表达。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实成功克隆了MYCT-1 cD-NA全长并正确插入了表达载体,在GES-1细胞中检测到MYCT-1 mRNA和蛋白。结论成功构建了MYCT-1真核表达载体,可在GES-1细胞中稳定表达。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

背景:神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达.目的:构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体.方法:针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率.结果与结论:PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%.4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显.结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.