pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位。方法HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2。PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位。结果重组载体经PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中。结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位。     

BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的 构建骨成形蛋白-7(BMP-7)／绿色荧光蛋白(GFP)融合基因，观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位。方法 将小鼠BMP-7全长eDNA与GFP融合，连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中，以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞。采用Western blot方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞的表达；激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况。结果 限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7／GFP融合基因表达质粒。瞬时转染入肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加；GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中，而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面。结论 重组BMP-7／GFP融合蛋白具有GTP自发荧光的特性，且不影响BMP-7在细胞内的正确表达。     

BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的构建骨成形蛋白-7(BMP-7)/绿色荧光蛋白(GFP)融合基因,观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位.方法将小鼠BMP-7全长cDNA与GFP融合,连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中,以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞.采用Western blot方法检测BMP -7在肾小管上皮细胞的表达;激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况.结果限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7/GFP融合基因表达质粒.瞬时转染人肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加;GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中,而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面.结论重组BMP-7/GFP融合蛋白具有GFP自发荧光的特性,且不影响BMP-7在细胞内的正确表达.     

人GFP—AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWPI(associated with protein kinase Crelated kinase I，AWPI)表达载体,观察AWPI在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT—PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWPI cDNA编码区．并将其重组于GFP表达载体pEGFP—C2中。经酶切，序列鉴定分析后，将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导，转染293细胞。荧光显微镜观察AWPI在细胞内的表达和分布。结果 GFP—AWPI融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功，并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下，在不携带外源基因的空载体pEGFP—C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中；在重组质粒pEGFP—C2／AWPI转染的293细胞，绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP—AWPI融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

鼠伯氏疟原虫CSP基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei)环子孢子(CSP)全长基因和去除中央重复序列的CSP的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在Hela细胞中的表达。方法采用PCR技术,从伯氏疟原虫基因组中扩增全长CSP基因,将其定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP全长基因重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定;同样,采用PCR技术扩增PbCSP的N端和C端两个片段,先将C端片段定向克隆入pEGFP-N1,构建pEGFP/PbCSP-C重组质粒,再将PbCSPN端片段定向克隆入pEGFP/PbCSP-C,构建pEGFP/PbCSP'重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定。将pEGFP/PbCSP和pEGFP/PbCSP′分别用脂质体介导转染体外培养的Hela细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测融合蛋白的表达。结果PCR、酶切及测序证实目的基因PbCSP全长和片段分别正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,两种重组质粒转染Hela后,荧光显微镜及RT-PCR均检测到目的蛋白在Hela中表达。结论成功构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的伯氏疟原虫CSP全长基因和该基因片段的融合蛋白真核表达质粒,并在Hela细胞中获得表达。     

Construction of GFP-AWP1 fusion gene vector and its expression in 293 cells]

OBJECTIVE: To construct green fluorescent protein (GFP)-AWP1 (a novel human protein associated with protein kinase C-related kinase 1) fusion gene vector for observing the expression and localization of AWP1 in 293 cells. METHODS: The coding region in AWP1 cDNA was amplified by RT-PCR from human endothelial cell line ECV304 and recombined into pEGFP-C2 plasmid expressing GFP. After identification with restriction endonucleases and sequence analysis, the recombinant plasmid was transfected into 293 cells with the cationic liposome DOTAP as the transfection reagent. The expression and localization of AWP1 were observed under a fluorescence microscope. RESULTS: Restriction endonuclease assay and sequence analysis verified the successful construction of the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1, and GFP-AWP1 fusion protein was highly efficiently expressed in 293 cells. Under fluorescent microscope, green fluorescence was seen homogeneously distributed in the entire cell body of the cells transfected by the empty vector pEGFP-C2, but diffusely in the cytoplasm of the cells transfected by the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1. CONCLUSION: GFP-AWP1 fusion gene vector is successfully constructed and the fusion protein expressed in the cytoplasm of 293 cells.     

GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDAXX，并在HeLa细胞中表达，为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础。方法:用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP，筛选阳性克隆。将质粒pEGFP／hDaxx转染HeLa细胞，Western-Blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位。结果：成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核。结论:GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核。     

人BNIP3基因在Hela细胞中的表达及定位

目的：构建BNIP3-HA融合蛋白的真核表达载体,观察BNIP3在Hela细胞中表达及其定位。方法：采用两步克隆法将HA和BNIP3的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染Hela细胞。BNIP3经Alexa Fluor488免疫荧光标记,线粒体用MitoFluor Red589染色后在荧光显微镜下观察BNIP3的表达和定位。结果：重组质粒经酶切、聚合酶链反应（PCR）和测序鉴定构建正确,并在Hela细胞中能够表达,在荧光显微镜下观察,BNIP3-HA融合蛋白分布于线粒体。结论：成功构建BNIP3-HA融合蛋白表达载体并在Hela细胞线粒体中表达。     

蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定

目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白 (GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究.方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a( );在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性.结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性.结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究.     

外源性p38调节活化蛋白激酶细胞内定位研究

目的 研究外源性调节活化蛋白激酶 (PRAK)在细胞内的定位.方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并通过荧光显微镜观察外源性PRAK导入真核细胞后在细胞内的分布.结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中.结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察外源性PRAK主要分布在细胞核内.     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

TLR4红色荧光蛋白融合载体的构建与表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的含Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）基因的红色荧光蛋白融合表达载体（pDsRed1-N1/TLR4）,并观察在细胞内的表达情况。方法应用PCR扩增鼠TLR4全基因,将其克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1中,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后,转染到Hela细胞中,并利用Western blotting鉴定TLR4蛋白在细胞中的表达。结果重组pDsRed1-N1/TLR4融合蛋白在Hela细胞中持续高表达,经连续观察发现48h红色荧光表达量最高。结论成功构建带有红色荧光蛋白的TLR4基因表达载体,为研究TLR4在细胞内的相关生物学功能及与mircoRNA之间的关系提供了方便有力的工具。