恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb)，并对其特异性进行鉴定。方法 用柱层析纯化的GDH／GST重组融合蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株，用protein-G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，Western blot分析其特异性。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株，单抗均为IgGl，Western blot分析显示，6株单抗都与重组的GDH发生特异性结合。结论 制备的抗GDH杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为疟疾诊断技术的进一步研究奠定了基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的提纯及其特异性鉴定

恶性疟原虫乳酸脱氢酶得以与人红细胞ＬＤＨ（ＬＤＨ－ｒ）分开并纯化，并对他们的特性进行了比较，结果表明，ＬＤＨ－ｐ和ＬＤＨ－ｒ均可利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，促进乳酸盐与丙酮酸的相互转化。而只有ＬＤＨ－ｐ可更快速地利用ＮＡＤ类似物－乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸完成同一反应，ＬＤＨ－ｒ不能利用ＡＰＡＤ。在ＰＡＧＥ电泳中，ＮＡＤ使ＬＤＨ－ｐ和ＬＤＨ－ｒ均被染色，目前为一条带，后者为三条不同的带；当以ＡＰＡＤ染色     

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的　制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶 (GDH)的单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。　方法　用柱层析纯化的GDH/GST重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,用 protein G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,Westernblot分析其特异性。　结果　筛选出 6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,单抗均为IgG1,Westernblot分析显示 ,6株单抗都与重组的GDH发生特异性结合。　结论　制备的抗GDH杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗 ,为疟疾诊断技术的进一步研究奠定了基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的提纯及其特异性鉴定 (英文)

恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH—p)得以与人红细胞LDH(LDH—r)分开并纯化,并对他们的特性进行了比较。结果表明,LDH—p和LDH—r均可利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),促进乳酸盐与丙酮酸盐的相互转化;而只有LDH—p可更快速地利用NAD类似物—乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(acetyl pyridine adenine dinucteotide,APAD)完成同一反应,LDH—r不能利用APAD。在PAGE电泳中,NAD使LDH—p和LDH—r均被染色,前者为一条带,后者为三条不同的带;当以APAD染色时,只有LDH—p被更深地染色,LDH—r带均未显色。以上表明,两种LDH具有明显不同的生化、物理特性,易于区分。     

薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶的研究

目的建立一种敏感、简便、快速的恶性疟诊断方法.方法应用薄层色谱法检测体外培养的不同虫株恶性疟原虫感染红细胞中的恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH-p).结果该方法的敏感度可达10个原虫/μl～20个原虫/μl血.检测感染期相同、原虫密度均为5%的恶性疟原虫FCC-1/HN株、FCC-1/AH株、FCC/YN株感染红细胞的最高阳性稀释度不同,提示不同虫株恶性疟原虫体内的LDH可能存在着差异.整个检测过程30min,不需特殊设备,费用低廉.结论薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶敏感、简便、快速.     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法　采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果　得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论　LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶的研究

目的 建立一种敏感、简便,快速的恶性疟诊断方法。方法 应用薄层色谱法检测体外培养的不同虫株恶性疟原虫感染红细胞中的恶性疟 原虫乳酸脱氢酶（LDH-p)。结果 该方法的敏感度可达10个原虫/μl-20个原虫/μl血。检测感染期相同,原虫密度均为5%的恶性疟原虫FCC-1/HN株、FCC-1/AH株,FCC/YN株感染红细胞的最高阳性稀释度不同,提示不同虫株恶性疟原虫体内的LDH可能存在着差异。整个检测过程30min,不需特殊设备,费用低廉。结论 薄层色谱法检测恶性疟原虫乳酸脱氢酶敏感、简便、快速。     

恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫层析法检测试纸条的研制

目的 用氯金酸标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH）单克隆抗体（McAb），研制用于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的胶体金免疫层析（GICA）试纸。方法 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记抗恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶单克隆抗体，制成免疫层析检测试纸条。用该试纸条检测已知疟疾病人及健康人血样，鉴定方法的敏感性和特异性。结果 检测重组LDH抗原的最小量为5ng／ml；对30例恶性疟病人血样及40例间日疟病人血样进行检测，敏感性分别为83．33％和57．50％，检测100例健康者血样特异性为98．00％。结论 初步建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的GICA检测法。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的快速电泳法检测及影响因素

目的建立一种敏感、特异的恶性疟快速诊断方法。方法：应用快速电泳法检测恶性疟病人血样中恶性疟原虫乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－Ｐ），并对可能影响检测结果的几种因素进行观察。结果：检测４０份恶性疟病人血样，３８份检测出ＬＤＨ－Ｐ，阳性率为９５％，假阴性率为５％；同时检测４０份间日疟病人血样和２０份正常人血样，均为阴性，无假阳性；血样反复冻融可使ＬＤＨ－Ｐ受到破坏，蛋白酶抑制剂对保存血样中的ＬＤＨ－Ｐ保护作用明显；新鲜血样中加否蛋白酶抑制剂，检测结果差异不明显。结论：快速电泳法检测ＬＤＨ－Ｐ诊断恶性疟，方法简便、敏感性和特异性高，具有很好的现场应用价值。检测新鲜血样中ＬＤＨ－Ｐ效果好。     

间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析

目的对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析。方法根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析。将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Westernblotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白。结果Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%。T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个。Westernblotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清。中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体最高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的最高抑制率仅为30.5%。结论Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析

目的 制备恶性疟原虫（FCC1/HN株）融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体，分析其生物学特性及功能。 方法 用PfCP-2.9免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行融合，制备单克隆抗体，并分析其特性。 结果 获得1株能分泌抗PfCP-2.9的小鼠杂交瘤细胞株单克隆抗体F12D，经免疫球蛋白类型和亚类鉴定为IgG1。ELISA和蛋白质印迹法（Western blotting）显示单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，F12D所识别的PfCP-2.9抗原表位不能耐受还原剂巯基乙醇，表明F12D识别的是构象表位。间接免疫荧光试验（IFA）显示F12D可识别培养的FCC1/HN。体外抑制试验结果显示，F12D终浓度为0.3 mg/ml时，对FCC1/HN的抑制率为56%。 结论 单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，其所识别表位为构象表位，F12D可识别体外培养的FCC1/HN，并对其生长具有抑制作用。     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因的分子克隆及序列分析

目的　了解恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法　PCR扩增恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH基因全编码区 ,产物经EcoRⅠ +SalⅠ酶切后 ,定向克隆至pGEX - 4T - 1表达质粒 ,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序 ,与其它生物LDH进行同源性分析。 结果　成功地扩增了恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH编码基因 ,大小为 95 1bp ,无内含子 ,与Honduras株LDH基因相比 ,两者有 5个碱基不同 ,推导的氨基酸序列有 4个氨基酸残基不同 ,与刚地弓形虫、隐孢子虫和芽孢杆菌的同源性分别为 49.0 6 % (15 6 / 318)、42 .5 8% (132 / 310 )、31.6 1% (98/310 )。与人的LDH -A、LDH -B和LDH -C的同源性分别为 30 .19% (93/ 30 8)、2 9.5 5 % (91/ 30 8)和 33.44 % (10 4/ 311)。结论　FCC1/HN株与Honduras株LDH高度同源 ,疟原虫LDH明显不同于其它生物LDH     

乳酸脱氢酶法检测恶性疟原虫融合蛋白-2.9免疫血清体外抑制效果

目的 用乳酸脱氢酶（LDH）法检测恶性疟原虫融合蛋白（PfCP-2.9）免疫兔血清体外抑制恶性疟原虫生长的效果。 方法 将恶性疟原虫起始培养物的原虫率稀释为（0.4±0.1）%，红细胞压积为2％，使用不同浓度恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9免疫兔血清进行恶性疟原虫体外生长抑制试验，40～42 h后分别用LDH检测法和传统镜检计数法检测原虫生长抑制率。 结果 PfCP-2.9免疫兔血清在体外对恶性疟原虫有较强的抑制作用。LDH测定法与传统镜检法测得体外恶性疟原虫抑制率相近（分别为97%和100%），两者差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 LDH法检测恶性疟原虫体外抑制试验是一种简单、可行的实验方法。     

间日疟原虫海南分离株乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

用PCR扩增间日疟原虫海南分离株基因组DNA中乳酸脱氢酶(LDH)全长基因,命名为PvLDH/HN(GenBank登录号为FJ527750)。生物信息学分析表明,PvLDH/HN全长951bp,编码316个氨基酸残基,与间日疟原虫SalvadorI株、Belem株LDH等分离株核苷酸序列同源性均为99.89%(950/951),氨基酸序列同源性均为100%(316/316)。拓扑结构分析显示,该蛋白具有2个α螺旋跨膜区域,可能是膜蛋白。三级结构模型显示主要抗原表位82～95aa位于蛋白表面,构成特异性底物结合环,提示该位点是可能的药物作用靶点及免疫诊断抗原表位。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

目的　在大肠埃希菌 (E .coli)中尝试非融合蛋白技术可溶性表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶 (GDH) ,以获得具有相对完整空间表位的重组非融合GDH。　方法　将恶性疟原虫GDH基因克隆到pET-23 (a)表达载体中 ,转化E .coli BL21菌株 ,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,菌体反复冻融后 ,通过十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析表达产物的存在形式 ,可溶性表达产物经Source-Q及Source-S层析纯化并用SDS PAGE分析纯度。通过蛋白质印迹试验鉴定表达和纯化产物的免疫学活性。　结果　可溶性重组GDH分子占宿主蛋白 15 %左右 ,相对分子质量为 5 2 0 0 0。经过阴离子和阳离子交换层析纯化后 ,GDH纯度达 90 %以上。该蛋白质具有良好的抗原性。　结论　通过E .coli表达系统和柱层析分离技术可获得高纯度、具有相对完整空间表位的重组GDH分子。     

抗人丙二醛修饰低密度脂蛋白单克隆抗体的制备和免疫学性质

本文报道两株抗丙二醛修饰的低密度脂蛋白单克隆抗体（ＨＭＬ、ＨＭＬ２），两者均有较高的抗体效价，抗体类型为ＩｇＧ２ａ。单抗相加实验表明，ＨＭＬ１和ＨＭＬ２识别同一抗原位点。竞争性ＢＡ－ＥＬＩＳＡ实验显示：ＨＭＬ１能够识别丙二醛修饰的低密度脂蛋白、丙二醛清蛋白、丙二醛聚赖氨酸。但与天然低密度脂蛋白无交叉反应。推测ＨＭＬ１抗原位点与低密度脂蛋白在修饰过程中丙二醛和载脂蛋白Ｂ上的赖氨酸残基形成的共价结合物