沉默激酶功能区受体抑制前列腺癌PC-3细胞的裸鼠体内成瘤能力

目的 研究激酶功能区受体(KDR)基因表达沉默后对前列腺癌PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响.方法 将15只5周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为干扰组、阴性质粒组和未转染组,每组5只.分别接种构建的pSilencer 3.1-KDR siRNA表达质粒转染PC-3细胞、阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞以及未转染的PC-3细胞于裸鼠皮下;观察各组PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率、瘤体生长速度以及平均瘤质量等方面的变化,RT-PCR和Western blot技术检测瘤体KDR基因和蛋白表达.结果 pSilencer3.1KDR质粒转染组的裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组;与未转染组和PSilencer3.1-NC组相比,pSilencer3.1-KDR组肿瘤的生长受到明显抑制,平均体积较小(0.28 cm3 vs 0.721 cm3,0.715 cm3,P＜0.01),平均瘤质量较轻(0.14g vs 0.648g,0.635g,P＜0.01);裸鼠肿瘤组织中KDR mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 RNAi介导的KDR基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内的瘤体生长速度,KDR有可能成为肿瘤治疗的新靶点.     

CD59锚定蛋白对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导中的增强效应

目的用前期构建好的CD59pSUPER-RNAi质粒转染Jurkat细胞,探讨CD59特异性沉默前后CD59对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导的相关作用。方法采用Lipofectamine2000转染Jurkat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系,利用RT-PCR检测转染后CD59在基因水平的表达抑制效果。实验分为未转染的Jurkat细胞组(A组),转染空质粒pSUPER组(B组)和转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组(C组),用噻唑蓝(MTT)比色法,Western blot技术和激光共聚焦扫描显微镜分别检测交联CD59单抗与固相化CD3单抗联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应,ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平及细胞浆内钙离子的变化。结果重组载体转染后,经G418筛选得到稳定转染细胞系,RT-PCR结果表明转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组CD59分子的表达受到抑制。转染干扰质粒Jurkat细胞组CD59与CD3联合作用后细胞增殖能力,ZAP-70酪氨酸磷酸化水平及钙离子浓度均明显低于未转染组和转染空质粒组(P<0.05);但未转染组和转染空质粒组之间无差异。结论 CD59对CD3介导T细胞活化信号转导有增强效应。     

小干扰RNA抑制卵巢癌模型裸鼠移植瘤葡萄糖调节蛋白94的表达及意义

背景：一些实验在模型鼠移植瘤中葡萄糖调节蛋白94被敲除后,细胞黏附中断,刺激肝起源细胞增殖,进而促进肝肿瘤的发生,推测葡萄糖调节蛋白94在肝癌中起到保护作用。 目的：应用小干扰RNA技术抑制裸鼠卵巢癌模型皮下移植瘤内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白94的基因表达,探讨移植瘤中葡萄糖调节蛋白94基因及蛋白表达的变化对移植瘤生长的影响。 方法：从GeneBank中选取人类葡萄糖调节蛋白94基因序列,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6 的真核表达载体psiSTRIKETM/葡萄糖调节蛋白94。建立人卵巢癌HO-8910细胞株裸鼠皮下接种模型,并将真核表达载体转染入裸鼠移植瘤体内,观察肿瘤生长情况。卵巢癌裸鼠模型经过不同给药方案干预后分为特异性小干扰RNA组,非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组, RT-PCR和免疫组化SP法检测葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白在肿瘤内的表达情况,并观察模型裸鼠的移植瘤生长情况。 结果与结论：成功构建RNA干扰质粒载体,所有裸鼠模型均接种成功,5 d后即可见皮下肿瘤形成,14 d左右肿瘤直径达7-10 mm。转染质粒完毕后抑瘤率为65.1%,与非特异性小干扰RNA组和生理盐水对照组比较,差异有显著性意义(P < 0.01)。psiSTRIKETM/GRP94治疗后瘤体内葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白显著下调(P < 0.01)。说明靶向葡萄糖调节蛋白94 mRNA的小干扰RNA可显著抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导葡萄糖调节蛋白94 mRNA和蛋白表达下调所致。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的 探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响.方法 裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预.随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD).结果 HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＜0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＞0.05].HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P＜0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P＞0.05].结论 针对HOXB7 siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成.     

siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用

目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RT-PCR和Western blot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确;重组载体转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆,RT-PCR和Western blot表明,稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功,CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用降低,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。     

siRNA对VEGF蛋白表达的影响及对裸鼠移植肾癌的抑制作用

目的探讨siRNA沉默血管内皮生长因子（VEGF）基因对人肾癌裸鼠移植瘤VEGF蛋白的表达水平及生长抑制作用的影响。方法化学合成针对VEGF的siRNA序列,通过脂质体将VEGF-siRNA转染到ACHN细胞中,将转染VEGF-siRNA的ACHN细胞（A组）、转染空质粒的ACHN细胞（B组）及未转染的ACHN细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下。在SPF环境中饲养裸鼠并观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,每隔5d测定移植瘤体积大小（肿瘤的长轴L,短轴W,肿瘤体积V=1/2LW2）,绘制肿瘤生长曲线,采用免疫组化及Western blot法测定裸鼠移植瘤组织切片中VEGF蛋白的表达水平。结果 A组小鼠移植瘤成瘤及生长明显缓慢,移植瘤的体积和质量均低于B、C组,差异有统计学意义（P〈0.05）;移植瘤组织切片免疫组化及Western blot法检测结果提示：与B、C组相比,A组中VEGF蛋白表达量降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;而B、C组间瘤体的体积重量及VEGF蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 VEGF在肾癌的发生、发展中起着重要作用,化学合成的VEGF-siRNA可特异性抑制肾癌细胞中VEGF的表达,抑制肿瘤的生长增殖。     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响。方法裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预。随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD)。结果HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P<0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P>0.05]。HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P<0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P>0.05]。结论针对HOXB7siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成。     

RNAi沉默 N-cadherin 表达对 EC9706细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的: 探讨RNAi沉默 N-cadherin 表达对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞体内生物学行为的影响。方法: 通过逆转录病毒介导的RNAi技术将 N-cadherin 基因的RNA干扰载体pMSCVneo/N-cadherin质粒及对照质粒pEGFP-MSCVneo质粒分别转染至人食管癌细胞系EC9706,运用G418进行抗性克隆的筛选和扩增,进而得到稳定转染的人食管癌细胞系EC9706(分别命名为干扰载体组和空载体组),将正常对照组、空载体组和干扰载体组EC9706细胞通过皮下注射的方式接种于裸鼠背部肩胛区,比较各组裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤体终重量及终体积等情况。运用免疫组织化学方法和Western blotting方法检测3组裸鼠移植瘤组织中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表达情况。TUNEL法检测3组裸鼠移植瘤组织中细胞的凋亡水平。结果: (1)与正常对照组和空载体组相比较,干扰载体组裸鼠移植瘤的生长速率、成瘤大小、瘤体终重量和终体积明显降低(P<0.05)。(2)与正常对照组和空载体组相比,干扰载体组裸鼠移植瘤组织中N-cadherin和MMP-9的蛋白表达均下调(P<0.05),而E-cadherin的蛋白表达则无明显变化(P>0.05)。(3)与正常对照组(51.55±4.68)和空载体组(54.17±5.26)相比,干扰载体组(106.81±6.47)裸鼠移植瘤组织中凋亡的阳性细胞数明显增加(P<0.05)。结论: RNAi沉默 N-cadherin 表达可明显抑制EC9706细胞裸鼠体内移植瘤的生长,其作用机制可能是通过下调MMP-9的表达,降低细胞对细胞外基质的降解能力,进而降低EC9706细胞的体内侵袭力。RNAi沉默 N-cadherin 表达具有体内抑制食管鳞状细胞癌细胞生长的作用。N-cadherin可望成为抗食管鳞状细胞癌治疗的潜在分子靶点。     

转染外源性p16基因对大鼠恶性胶质瘤的生长抑制作用

探讨p16基因在体内对恶性胶质瘤的生长抑制作用。将外源性p16基因导入C6细胞内，应用立体定向技术将C6细胞种植于SD大鼠颅内尾状核头部，用核磁共振（MR）扫描技术，动态观察颅内肿瘤生长情况，并通过免疫组化，原位杂交和细胞凋亡检测肿瘤细胞的增殖活性，结果显示，转染组和治疗组大鼠生存期较对照组明显延长。治疗组肿瘤随时间的延长逐渐缩小，免疫组化显示转染组和治疗组p16蛋白表达明显增强，原位杂交和细胞凋亡检测表明，转染组和治疗组大鼠肿瘤细胞增殖活性降低。本实验表明，p16基因在体内有抑制恶性胶质瘤生长的作用；瘤体内注入p16cDNA质粒-脂质体复合物，可使肿瘤生长受到明显抑制。并使多数肿瘤消失。     

多基因共沉默治疗人喉鳞癌裸鼠移植瘤

目的 探讨针对血管内皮生长因子(VEGF)、端粒酶逆转录酶(TERT)、Bcl-xl的3个短发夹状双链RNA(shRNA)的串联表达质粒对人喉鳞癌裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制.方法 构建串联表达3个shRNA的质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl.建立人喉鳞癌Hep-2细胞系荷瘤裸鼠模型.将该质粒转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况.荧光定量即时PCR检测三种目的 基因的mRNA在肿瘤组织中的表达情况,Western blot法检测三种蛋白的表达,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡,免疫组织化学sP法检测肿瘤组织微血管密度.结果 与治疗前比较,质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl注射裸鼠皮下移植瘤后,肿瘤生长明显受抑制,治疗后14 d抑瘤率达91.2%.三个目的 基因的mRNA及蛋白表达水平比治疗前均有显著下降.移植瘤组织内检测到大量凋亡细胞,凋亡指数为(60.34±5.32)%.治疗组微血管密度明显低于生理盐水对照组及阴性质粒处理组.结论 pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl能高效特异性地同时抑制3个靶基因在人喉鳞癌Hep-2细胞中的表达,增强基因沉默的多样性,并显著的抑制移植瘤的生长,提示未来应用多基因共沉默治疗喉鳞癌可能具有广阔的前景.     

CD59锚定蛋白对CD55介导的T细胞信号转导的增强效应

目的:研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59对CD55介导T细胞信号转导的增强效应。方法:实验分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)及转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)。用RT-PCR检测3组细胞中的CD59基因表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法、免疫印迹技术和激光共聚焦扫描显微镜分别检测CD55与CD59联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应,Src家族酪氨酸激酶(SrcPTK)磷酸化的水平及细胞内钙离子的变化。结果:稳定转染后,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被成功抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD55与CD59联合作用后增殖能力,SrcPTK磷酸化水平及钙离子浓度均明显高于Ⅲ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组之间无差异。结论:CD59可增强CD55对T细胞信号转导的效应。     

CD46 RNAi对CD59介导的T细胞信号转导的作用研究

目的构建携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,研究糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白CD59与CD46在介导T细胞信号转导中的相关性。方法将能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,转化大肠杆菌JM109并转染Jurkat细胞。将Jurkat细胞分为未转染的Jurkat细胞组(Ⅰ组)、转染空质粒的Jurkat细胞组(Ⅱ组)、转染CD59干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅲ组)及转染CD46干扰质粒的Jurkat细胞组(Ⅳ组)。用RT-PCR、Western blot技术检测各组细胞中的CD59、CD46基因的表达水平。用噻唑蓝(MTT)比色法检测CD46与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应。结果重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确,构建成功,稳定转染后,Ⅳ组细胞CD46分子的表达被成功抑制,Ⅲ组细胞CD59分子的表达被抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD46与CD59单抗联合作用后,增殖能力明显高于Ⅲ组、Ⅳ组(P<0.05);但Ⅰ组和Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组之间无差异。结论 CD59可增强CD46对T细胞信号转导的效应。     

转录因子Sp1在肿瘤细胞CD59表达调控中的作用

目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1对CD59表达的影响.方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418筛选建立稳定表达转染基因的细胞株.RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Sp1和CD59基因的表达,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用.结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体.转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的PC-3细胞CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低.结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础.     

CD59 Silencing via Retrovirus-Mediated RNA Interference Enhanced Complement-Mediated Cell Damage in Ovary Cancer

CD59, belonging to membrane complement regulatory proteins （mCRPs）, inhibits the cytolytic activity of complement and is over-expressed in solid cancers, including ovary cancer. The aim of the present study was to construct recombinant retrovirus encoding shRNA targeted human CD59 and infect A2780 cells in order to investigate the relationship between decreased CD59 expression and tumorigenesis of ovary cancer, siCD59 and siCD59-C were successfully constructed and identified by PCR, restriction endonuclease analyses and DNA sequencing, respectively. The siCD59 was able to efficiently infect A2780 cells, which was confirmed by Western blotting. When incubated with fresh normal human serum （8%, v/v） for 1 h at 37℃, the cell viability was decreased and cell damage was increased in siCD59 infected A2780 cells compared to siCD59-C infected cells. This led to the activation of caspase-3. The apoptosis in siCD59 infected cells was shown with hypercondensed nuclei using Hoechst staining. Meanwhile, the weight of ovary tumor graft in nude mice was significantly decreased in siCD59 group compared to that of siCD59-C group. And the expression of CD59 protein in tumor tissue in siCD59 group was significantly decreased. These results suggested that CD59 silencing in ovary cancer cells v/a retrovirusmediated RNAi can enhance complement-mediated cell damage, inhibiting growth of ovary cancer. CD59 might be a potential target for gene therapy in ovary cancer. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制HeLa细胞CD59表达及功能的研究

目的构建针对CD59基因的RNAi逆转录病毒载体并感染HeLa细胞,观察CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的变化。方法应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建3条含特异性CD59基因的重组载体,并以无关序列作为对照,脂质体法转染包装细胞并感染HeLa细胞,RT-PCR和ELISA检测靶细胞上CD59基因的抑制效果,染料释放试验检测CD59功能的改变。结果重组载体经鉴定正确,转染包装细胞成功,RT-PCR和ELISA结果显示能显著抑制CD59基因的表达,染料释放试验显示干扰组对补体溶破的抵抗作用降低。结论特异性沉默CD59基因的逆转录病毒载体构建和筛选成功,并能抑制CD59基因的表达及减弱CD59对补体的抑制功能,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤的免疫治疗开辟新途径。     

靶向沉默CD105和Ki67的表达对卵巢癌OVCAR3细胞生物学行为的影响

目的 探讨沉默CD105和Ki67基因表达对人卵巢上皮癌OVCAR3细胞系生物学行为的影响。 方法 CD105-siRNA、Ki67-siRNA、CD105-siRNA+Ki67-siRNA、阴性对照组分别转染卵巢癌OVCAR3细胞,用MTT法、划痕实验、Transwell小室及流式细胞术检测CD105、Ki67单基因沉默及联合基因沉默对人卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 结果 与各自的空白对照组及空脂质体对照组相比,单基因CD105-siRNA组、单基因Ki67-siRNA组和双基因联合干预组基因沉默后人卵巢癌OVCAR3细胞的增殖能力、迁移能力及侵袭能力均明显下调,其中联合干预组下降最为明显,癌细胞凋亡率明显增加,其中联合干预组增加最为明显,差异存在统计学意义（P<0.01,P<0.05）。 结论 CD105-siRNA和Ki67-siRNA表达载体均可抑制人卵巢癌OVCAR3细胞的增殖,并降低其细胞迁移和侵袭能力,诱导其肿瘤细胞凋亡。双基因联合沉默,效果更加显著。     

RNAi靶向沉默对人卵巢癌OVCAR3细胞CD105和Ki67基因表达的影响

目的 探讨RNAi靶向沉默对人卵巢癌OVCAR3细胞CD105和Ki67基因的表达。 方法 采用脂质体介导的基因法将不同浓度的CD105-siRNA、 Ki67-siRNA转染至体外培养的人卵巢癌OVCAR3细胞中,检测干扰前后人卵巢癌细胞中CD105、Ki67基因表达的变化以确定沉默效果。构建CD105-siRNA、Ki67-siRNA及各自的阴性对照序列并高效地转染人卵巢癌OVCAR3细胞,采用Western blotting和Real-time PCR从蛋白和基因水平检测CD105和Ki67的表达变化。 结果 转染CD105-siRNA或Ki67-siRNA终浓度为50nmol/L和100nmol/L的人卵巢癌细胞中CD105mRNA或Ki67mRNA的相对表达水平及CD105和Ki67的表达均明显低于空白对照组和阴性对照组（NC1）,差异具有统计学意义（P＜0.001）。 结论 CD105-siRNA和Ki67-siRNA能特异性抑制人卵巢癌OVCAR3细胞中的CD105和Ki67基因表达,下调mRNA和蛋白的表达水平。     

塞来昔布抑制COX-2 和PD-1 发挥抗肝癌作用

目的:研究塞来昔布的抗肝癌作用及其潜在的分子机制。方法:选取2012 年2 月~2016 年6 月在我院进行手术治疗的原发性肝细胞癌(HCC)患者65 例作为研究对象,另选取肝胆外科提供的正常肝脏组织标本15 例作为对照。采用免疫组织化学法(IHC)检测肿瘤及正常组织样本中COX-2 与PD-1 的表达。采用Pearson 相关性分析HCC 患者COX-2 与PD-1 的相关性。建立H22 肝癌细胞BALB/ c 小鼠模型,随机分为对照组、塞来昔布组和PD-1 抗体组(每组15 只)。给药4 周后处死全部存活小鼠,取出肿瘤。绘制肿瘤生长曲线及小鼠生存曲线。采用IHC 分析各组肿瘤组织中COX-2、PD-1 的表达水平及CD8+ T 与Foxp3 阳性Treg 细胞数。流式细胞术检测外周血中CD8+ T 与CD4+ CD25+ Treg 细胞数量。分离正常BALB/ c 小鼠的外周血单核细胞(PBMC),分别转染PD-1 及对照siRNA,使用塞来昔布处理后,Western blot 检测COX-2、PD-1、CD8 及Foxp3水平。结果:IHC 结果显示HCC 患者肿瘤组织中COX-2 与PD-1 的表达水平均显著高于对照组(P<0.001)。Pearson 相关性分析显示HCC 患者肿瘤组织中COX-2 的表达水平与PD-1 呈显著正相关(R2 =0.673,P<0.001)。塞来昔布、PD-1 抗体治疗小鼠的肿瘤生长曲线和生存曲线均显著优于对照组(P<0.05),塞来昔布组、PD-1 抗体组小鼠的肿瘤生长曲线和生存曲线相比差异均无统计学意义(P>0.05)。IHC 与流式分析显示,塞来昔布能显著降低肿瘤组织中PD-1 的表达(P<0.05);塞来昔布与PD-1 抗体均能使肿瘤组织及外周血CD8+ T 细胞显著增多(P<0.05),使Treg 细胞显著减少(P<0.05)。Western blot 结果显示,塞来昔布能显著降低小鼠PBMC 的COX-2、PD-1、CD8 及Foxp3 水平,而不影响转染PD-1 siRNA 后PBMC 的CD8 及Foxp3水平。结论:HCC 患者肿瘤组织中COX-2 与PD-1 均显著增高,塞来昔布可能通过抑制COX-2 调节PD-1影响肿瘤免疫从而发挥抗肝癌的作用。     

调控食管癌EC9706细胞DNA聚合酶β表达的初步研究

目的:观察DNA聚合酶β(DNA polβ)对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响。方法:以pSINsi-hU6为载体构建DNA polβ靶向的siRNA表达质粒,转染EC9706细胞,G418筛选。流式细胞术和裸鼠体内成瘤实验检测细胞增殖情况;实时荧光定量PCR检测细胞DNA polβmRNA的表达。结果:与空载体组和对照组相比,实验组1和实验组2(转染siRNA重组表达质粒)DNA polβmRNA的表达显著下降(P0.05),DNA polβ高表达组中mRNA的表达显著升高(P0.05);实验组1、实验组2和DNA polβ高表达组细胞周期S期比例显著增加(P0.05),肿瘤重量亦显著增加(P0.05)。结论:DNA polβ的高表达和过低表达,都会增加细胞的遗传不稳定性,可能在食管癌的发生中起一定作用。     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.