血小板源生长因子和脂多糖对吸烟大鼠小气道平滑肌细胞凋亡的影响

采用免疫组织化学和末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿嘧啶缺口末端标记法 (ＴＵＮＥＬ)来观察血小板源生长因子 (ＰＤＧＦ)和脂多糖 (ＬＰＳ)对体外培养的吸烟大鼠小气道平滑肌细胞Ｂｃｌ 2、Ｂａｘ和凋亡的影响 ,以探讨其对小气道平滑肌细胞凋亡的调节作用。材料与方法　 (1)主要试剂 :小鼠抗大鼠Ｂｃｌ 2单克隆抗体 ,小鼠抗大鼠Ｂａｘ单克隆抗体 (美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司 ) ,ＴＵＮＥＬ试剂盒 (德国宝灵曼公司 ) ,ＰＤＧＦ(Ｄｒ ＭａｒｓｈａＡ惠赠 ) ,ＬＰＳ(美国Ｓｉｇｍａ公司 ) ,免疫组织化学染色试剂盒和ＤＡＢ显色试剂盒…     

依那普利对高血压大鼠血管平滑肌细胞内游离钙及蛋白激酶C活性的影响

目的观察依那普利抑制培养的血管平滑肌细胞增殖的机制。方法以组织贴块法行自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverats,SHR)主动脉血管平滑肌细胞的分离培养,并以倒置显微镜α-SM肌动蛋白免疫组化法鉴定;分别采用甲基噻唑基四唑(MTT)法、氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法、荧光染料(FURA-2/AM)标记法。酶底物反应法观察依那普利含药血清对血管平滑肌增殖、细胞内游离钙、蛋白激酶C活性的影响。结果与模型组比较,依那普利含药血清对血管平滑肌增殖、脱氧核糖核酸(DNA)合成、细胞内游离钙、蛋白激酶C活性均有明显的抑制作用(P<0.01)。结论依那普利可能通过降低细胞内游离钙水平及抑制蛋白激酶C活性而发挥抑制血管平滑肌增殖和高血压血管重构的作用。     

胰岛素对SHR大鼠血管平滑肌细胞体外增殖相关基因表达的影响

目的探讨胰岛素对体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC) 增殖相关基因表达的影响.方法用贴块法分离培养VSMC,应用含448个与细胞增殖相关基因靶基因芯片分析大鼠血管平滑肌细胞在胰岛素干预后基因表达的差异,RT-PCR 检测胰岛素作用后VSMC中bFGF、TGFβ、PDGF、Matrix Gla和OPN各目的基因mRNA相对表达水平,采用免疫组织化学检测胰岛素作用后VSMC肌动蛋白(α-SM actin).结果胰岛素组VSMC的+3H-TdR掺入值(cpm)比对照组高54.6%(%P%<0.01);基因芯片分析发现与细胞增殖相关等36个基因的mRNA胰岛素干预前后培养的细胞表达差异(8.04%);RT-PCR检测Matrix Gla和OPN在培养的VSMC中mRNA的表达量,胰岛素组明显高于对照组(%P%<0.05),同时bFGF、TGFβ、PDGF的表达也是胰岛素组明显高于对照组(%P%<0.05);α-SM actin免疫组化结果显示对照组的α-SM actin比胰岛素组染色深.结论提示胰岛素介导大鼠血管平滑肌细胞增殖是多基因效应,胰岛素促进了VSMC的增殖与VSMC表型转换有关.     

胰岛素对SHR大鼠血管平滑肌细胞体外增殖相关基因表达的影响

目的　探讨胰岛素对体外培养的血管平滑肌细胞 (vascularsmoothmusclecell,VSMC)增殖相关基因表达的影响。方法　用贴块法分离培养VSMC ,应用含 4 4 8个与细胞增殖相关基因靶基因芯片分析大鼠血管平滑肌细胞在胰岛素干预后基因表达的差异 ,RT PCR检测胰岛素作用后VSMC中bFGF、TGFβ、PDGF、MatrixGla和OPN各目的基因mRNA相对表达水平 ,采用免疫组织化学检测胰岛素作用后VSMC肌动蛋白 (α SMactin)。结果　胰岛素组VSMC的3 H TdR掺入值 (cpm)比对照组高 5 4 .6 % (P <0 0 1) ;基因芯片分析发现与细胞增殖相关等 36个基因的mRNA胰岛素干预前后培养的细胞表达差异 (8 0 4 % ) ;RT PCR检测MatrixGla和OPN在培养的VSMC中mRNA的表达量 ,胰岛素组明显高于对照组 (P <0 0 5 ) ,同时bFGF、TGFβ、PDGF的表达也是胰岛素组明显高于对照组 (P <0 0 5 ) ;α SMactin免疫组化结果显示对照组的α SMactin比胰岛素组染色深。结论　提示胰岛素介导大鼠血管平滑肌细胞增殖是多基因效应 ,胰岛素促进了VSMC的增殖与VSMC表型转换有关。     

蛋白激酶C对慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道的作用

蛋白激酶C(PKC)在缺氧性肺动脉高压的发病机制中起着重要的作用。但PKC对正常和慢性缺氧肺动脉平滑肌细胞(PASMC)上电压门控钾离子通道(Kv通道)的影响尚少报道。我们的研究旨在探讨PKC对慢性缺氧PASMC膜上Kv通道的作用，以进一步阐明缺氧性肺动脉高压的发病机制。     

内源性硫化氢对吸烟大鼠小气道纤维化的保护作用

目的探讨内源性硫化氢（Hzs）对于吸烟诱导的COPD大鼠模型中小气道纤维化的影响。方法32只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、吸烟组、吸烟＋Hzs组和吸烟＋炔丙基甘氨酸（PPG）组,采用被动烟雾吸入法,共吸烟4个月,从第3个月起,每日吸烟前给予大鼠腹腔注射生理盐水、硫氢化钠（NaHS）（14μmol／kg）或PPG（37．5mg／kg）,取肺组织切片进行HE染色和天狼星红染色,观察肺组织病理形态改变,对小气道胶原沉积采用半定量分析,并进行小气道病理评分。Westernblot检测肺组织胱硫醚-γ-裂解酶（CGL）、I型胶原蛋白表达水平。结果与正常组比较,吸烟组小气道病理评分明显升高（P〈0．01）,NaHS干预后较吸烟组评分降低（P〈0．05）。偏振光显微镜下观察天狼星红染色切片,吸烟组和吸烟＋PPG组较正常组小气道周围胶原沉积显著增多（P〈0．01）,吸烟＋H2S组较吸烟组明显减少（P〈0．05）。与正常组相比,吸烟组大鼠肺组织I型胶原蛋白含量明显增多（P〈0．05）,NariS干预后I型胶原蛋白含量较单纯吸烟组明显降低（P〈0．05）。结论内源性H2S参与吸烟诱导的COPD大鼠小气道纤维化的病理生理过程,外源性给予H2S对小气道纤维化具有保护作用。     

Ad-Gax转染对缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡及其相关基因表达的影响

目的观察Gax基因转染对缺氧性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）凋亡及其相关基因表达的影响。方法腺病毒介导Gax转染体外原代培养的PASMCs。透射电镜观察细胞凋亡形态;原位细胞凋亡检测法观察Ad-Gax转染前后在常氧和缺氧处理2h,6h、12h、24h、48h大鼠PASMCs凋亡情况;免疫细胞化学法测PASMCsBcl-2、Bax蛋白表达。结果透射电镜观察到Ad-Gax转染后PASMCs产生凋亡现象。未转染缺氧刺激前后,均无或可见极少量的阳性细胞;Ad-Gax转染后,如无缺氧刺激,也无或仅可见少量的阳性细胞,予缺氧刺激后,阳性细胞显著增多,尤其在转染后24～48h更明显。转染组常氧、缺氧2h,6h、12h、24h、48h细胞凋亡百分率均显著高于未转染组（P〈0．01）。Ad-Gax转染前,与常氧时比较,缺氧刺激PASMCs后,Bax蛋白表达略为升高但无统计学意义;而Bcl-2蛋白表达显著升高,差异有统计学意义（P〈0．05）。Ad-Gax转染PASMCs后,缺氧刺激使Bcl-2蛋白表达显著降低（P〈0．01）,Bax蛋白表达显著增高（P〈0．01）。转染组细胞凋亡率与Bcl-2／Bax比值呈负相关（r=-0．53,P〈0．01）。结论Ad-Gax转染可诱导缺氧性PASMCs凋亡,其机制可能是通过上调Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白的表达,尤其是通过降低Bcl-2／Bax比值实现的。     

高糖条件下腺苷酸活化蛋白激酶对大鼠胃平滑肌细胞能量代谢调控机制的研究

目的探讨高糖条件下腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对大鼠胃平滑肌细胞能量代谢调控机制的影响。方法制备并确定糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠模型,实验分为正常对照(NC)组和DGP组,抗体芯片观察AMPK磷酸化通路的变化,确定能量代谢相关功能蛋白;SeahorseXFe细胞能量代谢分析系统观察2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)与化合物C(Compound C)对高糖条件下大鼠胃平滑肌细胞耗氧率(OCR)与细胞外酸化率(ECAR)的影响;沉默AMPK后,观察高糖条件下大鼠胃平滑肌细胞能量代谢相关功能蛋白变化。结果高糖条件下AMPK抑制大鼠胃平滑肌细胞OCR的基础呼吸、最大呼吸值、三磷酸腺苷产量(P<0.05),促进大鼠胃平滑肌细胞ECAR的糖酵解水平和能力(P<0.01)。抗体蛋白芯片发现18个磷酸化差异抗体,涉及与能量代谢相关蛋白包括:p53、Ca²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、Ca²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)、磷脂酰肌醇特异性磷酯酶C-β3(PLC-β3)、蛋白激酶A(PKA)、乙酰CoA羧化酶1(ACC1)、真核延伸因子2(eEF2)、真核延伸因子激酶2(eEF2K)。与HG(24 h)组比较,HG(48 h)组p53、ACC1、eEF2表达升高(P<0.05或P<0.01),PLC-β3表达降低(P<0.01)。与HG(48 h)组比较,HG(48 h)+siRNA组p53、ACC1表达降低(P<0.01)。与HG(24 h)组比较,HG(48 h)组p-CaMKⅡThr³⁰⁵/CaMKⅡ与p-CaMKⅣThr^196/200/CaMKⅣ比值升高(P<0.01)。与HG(48 h)组比较,HG(48 h)+siRNA组p-CaMKⅡThr³⁰⁵/CaMKⅡ比值降低(P<0.01)。HG(48 h)组PKA活性高于HG(24 h)组(P<0.01)。结论高糖条件下AMPK通过调控p53、ACC1、eEF2、CaMKⅡ、CaMKⅣ、PLC-β3及PKA生物学作用,抑制大鼠胃平滑肌细胞线粒体代谢途径及促进糖酵解途径。     

蛋白激酶C在支气管哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖中的信号转导机制研究

目的　探讨蛋白激酶C(PKC)信号转导途径在支气管哮喘 (简称哮喘 )大鼠气道平滑肌细胞 (ASMC)增殖中的作用。方法　 (1) 4 8只Wistar大鼠分为哮喘组 (A组 )及对照组 (B组 ) ,根据激发时间 (2、4、8周 )又分别分为A1、A2 、A3 组和B1、B2 、B3 组 ,其中A、B组大鼠各 12只 ,A2 、A3 、B2 及B3 组各 6只。用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐 (MTT)法、增殖细胞核抗原 (PCNA)染色等方法观察每组ASMC增殖 ;(2 )用PKC激活剂 12 肉蔻酰 13 乙酸佛波酯 (PMA)及抑制剂Ro 31 82 2 0分别干预A1、B1组ASMC ,观察ASMC增殖的变化 ;(3)用逆转录 聚合酶链测定 (RT PCR)和免疫细胞化学法检测A1、A2 、A3 组和B1组ASMCPKC α的表达。结果　 (1)A组ASMCS期比例、吸光度 (A)值、PCNA表达增高 ,与B组比较差异有显著性 (P <0 0 1)。 (2 )A1组ASMCS期比例、A值、PCNA阳性表达率在干预前分别为 (19± 3) %、0 4 5 9± 0 0 36、(80± 10 ) % ;10nmol/LPMA处理后分别为 (2 7± 4 ) %、0 5 99± 0 0 78、(95± 9) % ;5 0nmol/LPMA处理后为 (14± 3) %、0 346± 0 0 38、(5 3± 8) % ;Ro 31 82 2 0处理后为 (14± 3) %、0 343± 0 0 4 8、(4 9± 8) %。各干预剂处理后与处理前比较差异均有显著性 (P <0 0 1) ;5 0nmol/LPMA处     

蛋白激酶Cα与血管平滑肌细胞表型转化

目的　建立血管平滑肌细胞 (VSMC)的收缩及合成表型 ,探讨蛋白激酶Cα(PKCα)亚型对其转化的影响。方法　用酶消化法及传代培养分别获 2种VSMC表型细胞 ,细胞特性通过免疫细胞化学及透射电镜鉴定。用竞争性逆转录聚合酶链反应 (竞争RT PCR) ,观察 2种表型细胞的PKCα表达。结果　酶消化法分离的VSMC较传代培养的VSMC显示缬蛋白(desmin)表达呈强阳性。2种表型细胞经超微结构观察分别显示典型的收缩表型及合成表型变化。PKCα表达在酶消化法分离的VSMC中明显高于传代培养的VSMC(t=3 .5 68;P <0 .0 5 )。结论　PKCα亚型在收缩表型的表达量明显高于合成表型 ,提示该亚型对维持VSMC的收缩表型起了一定作用。研究中选用竞争RT PCR方法克服了以往使用 β actin的局限性。     

过氧化氢对大鼠主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白基因表达的影响

目的观察不同浓度的过氧化氢(H2O2)对培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)骨桥蛋白(OPN)基因表达的影响。方法用含10%小牛血清的DMEM培养液体外培养大鼠主动脉VSMC,随机分为对照组,H2O2不同浓度(10,50,100μmol/L)干预组,应用逆转录聚合酶链反应及Western blot技术结合吸光度扫描分析,观察H2O2对VSMC的OPN表达的影响。结果不同浓度H2O2均明显刺激VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达,且具有剂量依赖性促进作用。结论H2O2能在基因水平上刺激VSMC的OPN的表达。     

银杏叶制剂对低氧肺动脉平滑肌蛋白激酶Cα表达的影响

银杏叶提取物可明显抑制低氧性肺动脉高压的发生并阻止低氧介导的右心室肥厚的形成[1 3 ] ,但机制尚未明确。我们应用原位杂交、免疫细胞化学及四甲基偶氮唑盐 (ＭＴＴ)微量比色法等技术观察了银杏叶制剂 (ＢＮ5 2 0 2 1)对低氧肺动脉平滑肌细胞 (ＰＡＳＭＣ)增殖速率及蛋白激酶Ｃ (ＰＫＣ)αｍＲＮＡ表达的影响 ,以探讨银杏叶制剂治疗低氧性肺动脉高压的机制。材料与方法　猪ＰＡＳＭＣ培养按贴块法进行 ,根据细胞生长呈典型的“峰与谷”结构 (图 1)及免疫荧光α 平滑肌肌动蛋白 (α ＳＭａｃｔｉｎ)阳性 (图 2 )鉴定为平滑肌细胞。取 3～ …     

三叶因子基因表达调控相关因子

三叶因子在黏膜修复与重建及肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要的作用,对其结构与功能及基因表达调控的研究一直是近20余年来黏膜保护及肿瘤研究领域的热点．目前的研究发现,许多转录因子如C／EBPβ、GATA家族、NF-κB等,调节蛋白质如雌激素、EGF及TGFα等,及其他化学物质如NSAIDs、TPA、硫氨素等均参与了三叶因子基因的表达调控过程．通过调节这些相关因子,我们可以充分发挥三叶因子生物学作用中的有利方面,避免其不利方面,为临床应用创造条件．     

DNA甲基化对大肠癌相关基因表达的调控意义

目的:探讨大肠癌发生与演进中p16,Rb,cyclin D1甲基化状态与蛋白表达的关系及意义．方法:提取正常黏膜、腺瘤、癌旁组织及癌组织基因组DNA,应用MSP法检测不同病变阶段组织中各基因的甲基化状态,并对其与蛋白表达及临床病理参数的关系进行分析．结果:在大肠癌发生与演进过程中,p16,Rb 基因甲基化率呈增高趋势,cyclin D1基因甲基化率呈下降趋势,p16(切缘:r=-0．185,P =0．173;腺瘤:r=-0．381,P=0．013:癌旁:r= -0．419,P=0．001;癌:r=-0．516,P=0．000)、 cyclin D1(切缘:r=-0．282,P=0．035;腺瘤:r= -0．329,P=0．033;癌旁:r=-0．298,P=0．026; 癌:r=-0．618,P=0．000)基因甲基化程度分别与其蛋白表达呈明显负相关,且在癌组织分化程度(p16:X2=11.232,P=0．002,cyclin D1:X2 =9．144,P=0．015)、浸润深度(p16:X2=6．229, P=0．013;cyclin D1:X2=8．023,P=0．006)和淋巴结转移(p16:X2=5．707,P=0．016;cyclin D1: X2=7．794,P=0．005)上有显著性差异．Rb基因的甲基化状态在Rb表达抑制上不起主要作用．结论:大肠癌p16高甲基化和cyclin D1低甲基化可能是p16失活和cyclin D1过表达的主要机制,在大肠癌的发生、发展中发挥重要作用, 对于大肠癌的早期诊断、恶性程度及预后判断有重要意义．     

丹参对高血压大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响

20 0 2年 9月至 2 0 0 3年 2月 ,我们采用自发性高血压大鼠 (SHR)为模型 ,以传统中药丹参进行干预 ,检测心肌蛋白激酶 C(PKC)在心肌中的表达 ,观察丹参对 PKC的影响 ,探讨丹参在预防高血压左室肥厚中的作用及可能机制。1　材料与方法1 .1　动物模型、分组及丹参用法　选用 SHR及正常血压大鼠 (WKY)由中国医学科学院动物中心提供 ,均为雄性 ,体重 2 75～ 3 3 0 g。 SHR大鼠随机分为两组 :高血压阳性对照组 (SHR组 ) 7只和丹参治疗组(SMB组 ) 7只。用年龄、数量配对的 WKY大鼠作为阴性对照组 (WKY组 ) 6只。丹参治疗组自第 8周龄…     

蛋白激酶C对大肠癌细胞转移特性调控的实验研究

目的:探讨蛋白激酶C(protein kinase C.PKC)对大肠癌细胞转移特性的调控作用。方法:采用羊膜侵袭培养系统和明胶酶谱分析的方法,研究了PKC激活剂PMA对人结肠癌细胞株HT-29体外侵袭作用的影响及PKC抑制剂Staurosporine(sP)对PMA的拮抗作用,以及研究了这种体外的侵袭作用与细胞分泌Ⅳ型胶原酶,包括72kDⅣ型胶原酶(MMP-2)和92kDⅣ型胶原酶(MMP-9)的关系。结果:PMA可显著增强HT-29细胞的侵袭性,与对照组相比,具有显著性差异(P<0.01).而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用。PMA还可增加HT-29细胞分泌MMP-2和MMP-9,而SP则可拮抗PMA的这种诱导作用,抑制MMP-2和MMP-9的分泌。结论:蛋白激酶C可能是调控肿瘤细胞侵袭、转移的重要因素。PKC的激活可诱导肿瘤细胞侵袭性增强和分泌MMP-2和MMP-9增加,SP可能通过抑制PMA对PKC的激活,进而抑制了肿瘤细胞的侵袭和分泌MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9的分沁与肿瘤细胞侵袭性有密切关系。