弧菌性脓毒血症的临床病理学特点

目的 观察弧菌性脓毒血症患者下肢的临床病变及组织超微结构特点，探讨弧菌临床病理变化与治疗和预后的关系。方法 自2002年8月至2003年10月间符合弧菌性脓毒血症早期临床诊断主要依据的患者5例，在应用抗菌药物、补液扩容、升压及1—2h内切开患肢以减压、引流、清创等外科治疗，观察患者的临床病理特点及患肢皮肤、肌肉、脂肪、坐骨神经、股动脉、股静脉的超微结构改变。结果 患者首先出现下肢足背或小腿肿胀、剧烈疼痛、局部红斑、数小时内血疱增多、融合成大血疱．皮肤大片淤血斑，下肢病变迅速扩大并向大腿或躯体蔓延。4例组织液24h后培养出创伤弧菌，1例培养出溶藻弧菌。2例下肢皮肤苍白、肌肉色红，CK正常或轻度升高，经清创、植皮后保存了患肢。另3例见皮肤脂肪坏死，筋膜肌肉坏死范围广，小血管血栓形成，患者的CK明显升高，2例下肢病变严重，行截去患肢治疗，4例患者治愈出院．通过光镜及电镜观察弧菌感染患者下肢病变组织，包括皮肤、肌肉、脂肪、坐骨神经、股动脉、股静脉，结合大体表现发现创伤弧菌脓毒血症患者下肢病变组织病理改变主要表现为炎症性改变。结论 及早正确认识下肢临床病理改变特点对该病的早期临床诊断十分重要关键，早期外科手术切开减压引流发现患肢皮肤与肌肉坏死，应彻底清除坏死组织，必要时行截肢治疗，可明显提高患者生存率。     

下肢创伤弧菌感染性脓毒血症的诊治体会

目的:总结成功救治下肢创伤弧菌感染性脓毒血症的诊治体会.方法:5例早期诊断为下肢创伤弧菌感染性脓毒血症的患者,入院1～2 h内患肢多切口切开减张、引流,创面局部外用磺胺米隆 氯霉素简单包扎,创面半暴露结合远红外线间歇照射治疗.7～10 d左右病情稳定或好转后予以清创术.2例患者清创后,病情不稳定,肢体感染重,肌肉大部坏死.为挽救生命而将患肢截肢;3例患者清创后予植皮修复创面.结果:5例患者全部治愈出院,3例下肢病变较轻,经清创、植皮后保存患肢治愈,2例下肢病变重,肌肉坏死明显,予截肢后治愈,随访至今均无异常.结论:早期诊断并尽早通过外科手术切开减张引流且彻底切除坏死组织,是提高下肢创伤弧菌性脓毒血症生存率的关键.     

创伤弧菌脓毒血症的临床和实验研究

我们从1996年起对临床患者下肢创伤弧菌感染引起创伤弧菌脓毒血症的流行病学及临床特点、临床早期诊断依据（标准）、临床早期抗菌药物及清创减压引流、截肢等综合治疗以及创伤弧菌脓毒血症小鼠模型、致病性及抗菌药物实验治疗等方面进行了临床与实验的系列研究。     

创伤弧菌脓毒血症的临床和实验研究

我们从1996年起对临床患者下肢创伤弧菌感染引起创伤弧菌脓毒血症的流行病学及临床特点、临床早期诊断依据(标准)、临床早期抗菌药物及清创减压引流、截肢等综合治疗以及创伤弧菌脓毒血症小鼠模型、致病性及抗菌药物实验治疗等方面进行了临床与实验的系列研究。1.流行病学及临床特点:患者男:女比为2.1:1,平均年龄50.3岁,发病在4～10月,多居住在温州沿海村镇,职业为渔民或农民,大多有长期嗜酒的不良习惯,有长期嗜酒     

下肢创伤弧菌感染所致脓毒血症的临床治疗

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)为嗜盐性海生G-杆菌属,Roland在1970年首先报道由创伤弧菌感染引起小腿坏疽和内毒素性休克,美国、西班牙、日本、我国台湾等国家和地区的一些沿海城市相继有创伤弧菌感染的临床报告,然而在祖国大陆沿海关于创伤弧菌感染的病例报道十分罕见。近几年来,我们报告过浙江温州地区陆续发生创伤弧菌脓毒血症引起死亡的病例。该病起病急,病情进展快,病死率高,是一种致命性的重要疾病。为此,我们对下肢创伤弧菌感染所致脓毒血症的早期临床治疗进行探讨。     

创伤弧菌致死性感染对小鼠血液系统的影响及主要脏器的病理变化

目的:观察创伤弧菌致死性感染对小鼠血液系统的影响及主要脏器的病理变化,探讨其可能的致死机制.方法:建立创伤弧菌致死性感染小鼠模型,ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、TF水平;采用全自动血液生化分析仪测定小鼠血清总胆红素、肌酐、尿素等生化指标含量;采用自动化血细胞分析仪进行全血细胞分析;创伤弧菌感染后8 h,取小鼠心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏,光镜、电镜下观察器官病理改变.结果:创伤弧菌感染后小鼠血清TNF-α、IL-1β、TF水平显著升高(P<0.05);血清尿素、肌酐、总胆红素、淀粉酶及丙氨酸转氨酶、尿酸、天冬氨酸转氨酶表达均显著升高(P<0.05);感染后白细胞计数、血小板计数、淋巴细胞百分比下降显著(P<0.05),红细胞计数、单核细胞百分比及血红蛋白水平显著上升(P<0.01).感染后小鼠主要脏器均表现为充血、水肿、组织结构破坏、炎症细胞浸润,电镜下可见肝细胞凋亡.结论:创伤弧菌致死性感染可能通过引发机体过度炎症反应,激活凝血系统,诱发机体广泛组织损伤,导致不可逆性多器官功能衰竭,最终引起死亡.     

中国海域分离的创伤弧菌的致病性及其对抗生素的敏感性研究

目的：就中国海域分离的创伤弧菌对小鼠的毒力、伤口感染力和对抗生素的敏感性进行实验研究．方法：昆明小鼠腹腔注射创伤弧菌悬液,观察一般状态、白细胞计数和血培养．第5日脱颈处死后解剖取脏器,用甲醛固定,石蜡包埋、制片,HE染色,光镜观察．在毒力实验中,昆明小鼠致伤后浸泡在含创伤弧菌的人工海水中45～60min,打捞后分笼于层流柜中饲养．于致伤浸泡后不同时间行白细胞计数及血培养,并观察一般状态和伤口炎性反应、定时取伤肢分泌物培养．将伤肢用甲醛固定,石蜡包埋、制片,HE染色,用光镜检查．用K—B法作创伤弧菌对各种抗生素药物敏感性实验．结果：小鼠注射创伤弧菌悬液后白细胞升高,死亡率为80％,小鼠的血、脾、肺、肝、肾、肠组织及腹腔培养物细菌培养均为阳性,病变部位以肺、肝及肾脏为重,病变性质主要为血液循环障碍,并由此引起不同程度的充血、出血及血停滞现象．海水浸泡伤创伤弧菌感染小鼠死亡率为20％;20％小鼠12h血培养阳性;6,12h及1～3d伤肢培养均为阳性,死亡小鼠及1d后活杀小鼠所有脏器培养均为阳性．感染小鼠的脏器可见到不同程度的炎症反应,以肺和肝脏较为明显,并有脓肿灶形成．结论：中国海域分离的创伤弧菌具有高度致病力,创伤弧菌除对氨苄西林、哌拉西林、氨曲南、磺胺类抗生素的敏感性较低外,对其它抗生素均有很好的抗菌活性．     

氧氟沙星等药物联合应用对创伤弧菌感染小鼠肌肉组织形态学改变的影响

目的:探讨氧氟沙星与甲基强的松龙、异丙嗪等药物联合应用对创伤孤菌感染小鼠的保护效果以及对小鼠骨骼肌超微结构改变的影响.方法:36只ICR(清洁级)小鼠,药物保护、阳性对照组各16只(生存率比较各12只).阳性对照组12只腹腔注射创伤弧菌(4.45×105CFU/ml)0.2ml,药物保护组12只在注射相同菌液后,肌肉注射12 mg/kg氧氟沙星、40mg/kg强的松龙和1mg/kg异丙嗪进行联合保护,4只注射生理盐水0.2ml作为菌液对照.分别取1 h、3 h、6 h、12 h阳性组、保护组小鼠后肢骨骼肌肌肉组织0.1 cm×0.1cm×0.1 cm置电镜固定液,超薄切片观察超微结构.结果:6 h阳性组和药物保护组生存率差异无显著性(P＞0.05);～12 h和-24 h病死率差异有显著性(P＜0.01和P≤0.01).3 h、6 h和12 h时段阳性组未死亡和药物保护组小鼠骨骼肌肌肉超微结构观察,其肌纤维实质性的损伤均不突出,而阳性组未死亡小鼠肌组织间质变化比较明显,出现肌组织间质水肿,胶原纤维排列稀疏、溶解.药物保护组较阳性对照组肌浆网扩张、胶原的溶解现象明显改善.结论:药物保护在一定程度上可改善创伤弧菌所致的骨骼肌损伤,缓解肌组织间质水肿和胶原溶解.     

创伤弧菌脓毒症治疗的研究现状

创伤弧菌性脓毒血症起病急，病情进展快．病死率高．是沿海地区发生的一种致命性疾病，实验研究表明乳酸左旋氧氟沙星、哌拉西林钠、头孢哌酮钠、奈替米星对创伤弧菌感染小鼠有较好疗效，头孢哌酮 左旋氧氟沙星、头孢哌酮 奈替米星、奈替米星 多西环素联用效果更好。临床研究表明早期临床诊断、早期联合抗菌药物治疗、尽早外科手术切开减压引流清创是提高患者生存率的关键。     

脓毒血症引起肺损伤的实验研究

目的 探讨脓毒血症引起肺损伤的相关机制.方法 将30只SD大鼠随机均分为正常对照组和模型组,1周后分别予等体积的生理盐水、8 mg/kg的脂多糖(LPS)尾静脉注射,48 h后取支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,测定BALF中的中性粒细胞计数;ELISA法测定肺组织和BALF中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)的浓度,称重并计算肺组织湿/干重比(W/D).观察小鼠肺组织病理切片并行肺损伤评分.结果 与正常对照组比较,模型组小鼠肺泡组织结构发生明显改变,大鼠肺组织肿大,有轻微的溃烂,且肺组织W/D较正常对照组显著增加,HE染色显示模型组组织膨胀,细胞水肿疏松,并有部分细胞脱落,肺损伤评分明显升高(P<0.01),正常对照组无明显病变.模型组BALF中的中性粒细胞计数显著提高(P<0.01),肺组织和BALF中TNF-α和IL-6浓度显著升高(P<0.01).结论 脓毒血症肺组织、BALF炎性因子TNF-α和IL-6明显升高,脓毒血症所致急性肺损伤的病变程度加重,中性粒细胞的浸润、肺组织炎症介质的产生和渗出增加.脓毒血症可引起的肺水肿和大分子物质渗出.     

Development of Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Vibrio vulnificus Based on Hemolysin （vvhA） Coding System

Objective To establish a TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR to detect Vibrio vulnificus based on the hemolysin gene （vvhA） coding cytolysin. Methods Primers and probes in the conserved region of the vvhA gene sequence were designed for the TaqMan real-time PCR to detect 100 bp amplicon from V. vulnificus DNA. Recombinant plasmid pMD19-vvhA100 was constructed and used as a positive control during the detection. Minimal amplification cycles （Ct value） and fluorescence intensity enhancement （ARn value） were used as observing indexes to optimize the reaction conditions of TaqMan real-time PCR. The TaqMan assay for the detection of Vbirio vulnificus was evaluated in pure culture, mice tissue which artificially contaminated Vibrio vulnificus and clinical samples. Results The established TaqMan real-time PCR showed positive results only for Vibrio vulnificus DNA and pMD19-vvhA100. The standard curve was plotted and the minimum level of the vvhA target from the recombinant plasmid DNA was 103 copies with a Ct value of 37.94±0.19, as the equivalent of 0.01 ng purified genomic DNA of Vibrio vulnificus. The results detected by TaqMan PCR were positive for the 16 clinical samples and all the specimens of peripheral blood and subcutaneous tissue of mice which were infected with Vibrio vulnificus. Conclusion TaqMan real-time PCR is a rapid, effective, and quantitative tool to detect Vibro vulnificus, and can be used in clinical laboratory diagnosis of septicemia and wound infection caused by Vibrio vulnificus.     

药物对创伤弧菌感染小鼠肾脏各时段超微结构病变的影响

目的：探讨药物对创伤弧菌感染小鼠肾脏各时段超微结构改变的影响。方法：清洁级ICR小鼠(25～27g)60只。分四组：空白对照和阴性对照各5只．阳性组25只(分1、3、6、12h四个时段)和药物保护组25只(分3、6、12h三个时段)。阴性组腹腔注射灭菌生理盐水O．2m1．阳性组与药物保护组腹腔注射2h增菌液O．2ml(10^5CFU／m1)．1h后保护组注射联合药物(氧氟沙星、肝素钠、地塞米松、非那根、间羟胺和多巴胺)。比较阳性组和保护组小鼠肾脏超微结构，同时采取空白对照、阴性对照、阳性对照和保护组血液37℃过夜培养。结果：阳性组各时段先后出现肾小管上皮细胞内皮细胞扩张、肿胀．细胞核固缩浓染。线粒体肿胀、嵴模糊或消失，微绒毛排列紊乱；保护组较之阳性组病变状况明显改善。结论：药物联合保护在一定程度上能改善创伤弧菌所致的肾脏进行性损伤。     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌方法的建立

目的建立双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。方法在Gen Bank数据库查找序列并比对后设计tdh和vvh A基因引物和探针。对PCR反应退火温度、引物、探针、Mg2+、Taq DNA聚合酶及d NTPs浓度进行优化,确定反应体系和反应条件,并对新建方法的特异性、灵敏度等方面进行分析,对模拟样品进行检测。结果建立了双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。该方法的特异性较好,检测限为103 CFU/ml。结论建立的双重荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测副溶血性弧菌和创伤弧菌。     

饲喂高浓度创伤弧菌对小鼠消化道的损伤研究

目的探讨高浓度创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)经食道感染小鼠的致病特点。方法 22只昆明小鼠,实验组16只,均强制性喂食Vv菌液(4.2×1012cfu/ml)0.6ml/只;对照组6只,喂食灭菌液体培养基(Marine broth 2216)0.6ml/只。观察小鼠一般情况,分别于实验后12h及48h采血并处死8只实验组小鼠和3只对照组小鼠,进行血液的Vv分离培养并取其消化道及重要脏器组织进行病理学观察。结果 48h组8只小鼠,有4只血培养结果为阳性;Vv经食道感染小鼠后导致其出现腹泻等消化道症状,病理学结果显示实验组小鼠食道及胃黏膜上皮部分缺损,小肠绒毛明显水肿,结肠肠壁平滑肌溶解断裂,消化道黏膜、黏膜下、肌层均可见不同程度的中性粒细胞浸润;小鼠主要脏器也出现不同程度的损伤,以肺和肾脏的广泛出血性损伤为主。结论 (1)高浓度Vv经食道进入小鼠胃组织后能部分存活,并进入肠道繁殖,从而引起小鼠腹泻症状,损伤小鼠消化道组织,并可入血引发败血症,导致小鼠肺、肾等多脏器的和损伤,造成小鼠死亡。(2)Vv可经消化道感染,所致炎症性病变特点为蜂窝织性炎。     

氧氟沙星等药物联合应用对创伤弧菌感染小鼠的保护作用

目的探讨氧氟沙星等药物联合治疗对创伤弧菌(Vv)感染小鼠的保护作用及对小鼠肝细胞超微结构的影响。方法清洁级ICR小鼠80只,随机分4组:阴性对照组10只,阳性组25只,氧氟沙星单独治疗组20只,氧氟沙星与其他药物联合治疗组25只。阴性对照组腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.2ml,阳性组与药物治疗组腹腔注射Vv增菌液0.2ml(约107CFU/ml),1h后单独治疗组注射氧氟沙星,联合治疗组注射氧氟沙星、肝素钠、地塞米松、异丙嗪、间羟胺和多巴胺。比较阳性组和治疗组小鼠腹腔注射Vv后12h存活率及小鼠肝组织各时段超微结构的动态改变。结果12h后,阴性对照组存活率100%;阳性组小鼠全部死亡,存活率为0;单独治疗组小鼠存活10只,存活率50%;联合治疗组小鼠存活24只,存活率96%。联合治疗组小鼠存活率与阳性组及单独治疗组相比差异均具有统计学意义(均P<0.01)。经电镜观察,阳性组3h后即出现肝内皮细胞扩张、肿胀,细胞核固缩,线粒体肿胀、嵴模糊或消失;5h肝细胞核进一步固缩,线粒体空泡样变性,肝细胞内质网空泡样改变。单独治疗组3h、5h时肝细胞存在不同程度的线粒体肿胀,内质网空泡样改变,并见核固缩。联合治疗组肝细胞病变轻于阳性组及单独治疗组。结论氧氟沙星等药物联合治疗在一定程度上能改善Vv所致的肝细胞进行性损伤,对Vv感染小鼠有一定的保护作用。     

Vibrio vulnificus. Man and the sea

To identify risk factors for Vibrio vulnificus infections, we performed a regional case-control study of 19 patients identified by isolates received at a state reference laboratory. Interviews with patients or surviving relatives and with three controls for each patient were compared in a matched analysis. Patients with V vulnificus wound infection were more likely than controls to have sustained a puncture wound while handling fresh seafood or to have been exposed to salt water. More patients with primary septicemia than controls had eaten raw oysters before the onset of illness. Other risk factors for septicemia included underlying liver disease, hematopoietic disorders, chronic renal insufficiency, use of immunosuppressive agents, and heavy alcohol consumption. Although V vulnificus infection is unusual, with a regional incidence of 0.8 per 100,000 population in this study, septicemia in the immunosuppressed patient is a devastating illness that can be prevented by not eating raw seafood.     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

乌司他丁联合抗菌药物对创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织的保护作用

目的 探讨乌司他丁联合抗菌药物对创伤弧菌脓毒症大鼠外周血清致炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）表达的变化和肺组织的病理改变.方法 将60只成年雌性SD大鼠随机分为：脓毒症对照组（C组）、氧氟沙星抗感染组（K组）、乌司他丁抗炎组（U组）、乌司他丁联合氧氟沙星抗炎抗感染组（L组）.每组各15只;所有大鼠均于腹腔内注射创伤弧菌悬液以建立脓毒症模型.同时采用ELISA法观察各组外周血IL-1 β、IL-6水平,并于光镜下观察肺组织病理变化和电镜下观察肺组织超微改变.结果 C组可见大量光滑的创伤弧菌菌落生长,K组和L组则均未见细菌生长.L组血IL-1 B和IL-6含量均较其他3组显著降低（均P＜0.01）;K组和U组血IL-6含量均较C组明显下降（均P＜0.01）.而3组IL-1 β含量的差异则均无统计学意义（均P＞0.05）.L组大鼠多数肺泡结构无明显改变,病理损害程度明显轻于C组.结论 乌司他丁联合抗菌药物对创伤弧菌脓毒症大鼠急性肺损伤具有明显保护作用.     

Foodborne Pathogens in Retail Oysters in South China

Objective To investigate the occurrence of important foodbome pathogens in shellstock Pacific oysters in the food markets in South China. Methods From July 2007 to June 2008, retail oysters were collected in different seasons from South China and analyzed for the prevalence and levels of Listeria monocytogenes, Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus. Results None of L. monocytogenes could be detected in any of the 202 oyster samples tested, while E vulnificus and E parahaemolyticus could be detected in 67 （54.9%） and 109 （89.3%） of the 122 oyster samples analyzed, respectively, with an MPN （most probable number） value greater than or equal to 3. V. wdnificus and Eparahaemolyticus with a more than 102 MPN/g were found in 36 （29.5%） and 59 （48.4%） of the 122 oyster samples, respectively. The tdh and trh genes were detected in 4 （0.3%） and 8 （0.6%） of the 1 349 V. parahaemolyticus isolates, respectively. Of the 122 samples, 4 （3.3%） was positive for either tdh or trh. The levels of E vulnificus and total V. parahaemolyticus in oysters in South China varied in different seasons. Conclusion V. vulnificus and pathogenic V. parahaemolyticus are frequently found in oysters in south China, which may pose a potential threat to public health. Data presented here will be useful for the microbiological risk assessment in oysters in China.     

重组金属蛋白酶蛋白的纯化及鉴定

目的 构建创伤弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)金属蛋白酶(vvp)基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性. 方法 采用pET-32a质粒构建vvp基因原核表达载体,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的重组金属蛋白酶蛋白rvvp表达,采用His-Ni亲和层析法提纯rVvp,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot鉴定其特异性和免疫原性. 结果 在1mmol/L IPTG诱导下,rvvp产量较高.提纯的rvvp经SDS-PAGE后仅显示分子量为86KD的单一蛋白条带.重组蛋白rvvp能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合. 结论 本研究成功地构建了创伤弧菌vvp基因高效原核表达系统,所表达的rvvp具有良好的免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原.