视网膜下间隙移植免疫赦免的实验研究

目的：探讨视网膜下间隙的免疫学特点。方法：将ＤＭＥＭ，同源视网膜，ＤＢＡ／２鼠视网膜加或不加完全福氏佐剂（ＣＦＡ）和人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）分别植入ＢＡＬＢ／Ｃ鼠的视网膜下间隙，２周后检测迟发型超敏反应（ＤＴＨ）、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）的特异杀伤率及行眼组织病理学检查。结果：实验组ＤＴＨ与阴性对照ＤＭＥＭ组无显著性差异，但ＣＴＬ的特异杀伤率与ＤＭＥＭ组存在显著性差异。ＤＢＡ／２鼠视网膜移植物存活。人ＰＢＭＣ移植发生免疫排斥反应。结论：视网膜下间隙移植，发生一定限度的免疫赦免     

鼠视网膜的免疫原性

为探讨视网膜的免疫原性,选择ＤＢＡ／２鼠（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｄ）为供体,Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｂ）或ＢＡＬＢ／Ｃ鼠（ＭＨＣ为Ｈ－２＾ｄ）为受体,把ＤＢＡ／２鼠的半个视网膜移植于受体鼠的皮下,２周后检测迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）。结果示移植组的迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞介导的细胞毒效应（ＣＴＬ）均低于阳性对照ＤＢＡ／２鼠脾细胞组,高于阴性对照假手术组。提示ＤＢ     

鼠视网膜的免疫原性

为探讨视网膜的免疫原性,选择ＤＢＡ／２鼠（ＭＨＣ为Ｈ２ｄ）为供体,Ｃ５７ＢＬ／６（ＭＨＣ为Ｈ２ｂ）或ＢＡＬＢ／Ｃ鼠（ＭＨＣ为Ｈ２ｄ）为受体,把ＤＢＡ／２鼠的半个视网膜移植于受体鼠的皮下,２周后检测迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）。结果示移植组的迟发型超敏反应（ＤＴＨ）和细胞介导的细胞毒效应（ＣＴＬ）均低于阳性对照ＤＢＡ／２鼠脾细胞组（Ｐ＜０．０１）,高于阴性对照假手术组（Ｐ＜０．０１）。提示ＤＢＡ／２鼠视网膜表达ＭＨＣⅠ类和Ⅱ类抗原及ＭｉｎｏｒＨＣ抗原,刺激受鼠产生较弱的细胞免疫应答。视网膜具有弱免疫原性。     

牛视网膜提取物对人-鼠杂合细胞抗体产生的影响

目的：探讨牛视网膜提取物对人－鼠杂合细胞抗体产生的影响。方法：在ＰＲＭＩ１６４０完全培养基（ＣＭ）中加入２０ｍｇ／Ｌ牛视网膜提取蛋白,配成牛视网膜培养基（ＢＲＥＭ）。用ＭＴＴ测定、细胞克隆技术、夹心ＥＬＩＳＡ方法和染色体分析,比较人－鼠杂合细胞Ｇ１２在两种培养条件下的细胞活力、克隆效率、人ＩｇＭ分泌和人染色体阳性细胞比率之间的差异。结果：用ＢＲＥＭ培养的Ｇ１２细胞活力高于用ＣＭ培养（Ｐ＜００５）。用ＢＲＥＭ培养的Ｇ１２细胞克隆中分泌人ＩｇＭ者占１２／２４,用ＣＭ培养的克隆只占２／４７。Ｇ１２细胞传代培养３个月后,用ＢＲＥＭ培养的上清人ＩｇＭ水平Ａ４９０为０３３５±００５０,用ＣＭ培养的上清为００７０±００２７（Ｐ＜００５）。前者含人染色体阳性的细胞为２０％,后者２５％,两者间没有差异（Ｐ＞００５）。结论：添加牛视网膜提取物的培养基可以提高人－鼠杂合细胞的活力和人ＩｇＭ抗体的分泌能力。维持人源性ＩｇＭ持续分泌的条件不仅取决于杂合细胞中人染色体的存在和稳定,还有其它未知因素在起作用,牛视网提取蛋白可以提供这方面的需要。     

选择P815作为DBA/2小鼠H─2抗原靶细胞

采用ＤＢＡ／２和Ｃ５７ＢＬ／６二组主要组织相容性复合体不相同的近交系小鼠，将ＤＢＡ／２小鼠的淋巴细胞植入Ｃ５７ＢＬ／６体内，分别选用Ｐ８１５和Ｄ８Ａ／２小鼠的淋巴细胞作为靶细胞，应用抗体－补体介导细胞杀伤的免疫学方法，研究Ｐ８１５作为ＤＢＡ／２小鼠Ｈ－２抗原靶细胞的可行性，实验结果显示，Ｐ８１５可以替代ＤＢＡ／２小鼠的淋巴细胞作为靶细胞。     

应用Fura-2/AM测定兔视网膜细胞内游离钙的方法

目的：建立适宜条件下，用荧光指示剂Ｆｕｒａ－２测定乳兔视网膜细胞内游离钙（简称［Ｃａ２＋］ｉ）的方法。方法：用酶解制备视网膜细胞悬液。Ｆｕｒａ－２／ＡＭ负载进行荧光测定。结果：经０．０５％胰蛋白酶消化１０分钟，可使细胞存活率达９０％以上。在３７℃条件下与Ｆｕｒａ－２／ＡＭ温育４０分钟，于３０分钟内测定为最佳条件。结论：静息状态下（［Ｃａ２＋］ｉ）水平为（２２３±２７）ｎｍｏｌ／Ｌ，其值在文献报道范围内。高钾去极化，在Ｋ＋为２５ｍｍｏｌ／Ｌ和５０ｍｍｏｌ／Ｌ时，分别使（［Ｃａ２＋］ｉ）增加了５９％和１４８％，由此证明视网膜细胞悬液制备和测定方法是可行的。     

厘米波致猪视网膜神经细胞损伤及硒的防护效应

目的：观察厘米波对体外培养的猪视网膜神经细胞的脂质过氧化损伤作用及亚硒酸钠的防护作用。方法：体外２猪视网膜神经细胞,按微波强度分为３组进行微波辐照１ｈ,选６０ｍＷ／ｃｍ＾２组进行防护在２液中加入不同浓度的亚硒酸钠后辐照,照后即刻测培养液温度、细胞风ＧＳＨ－Ｐｘ,ＳＯＤ活性、ＭＤＡ含量和细胞内Ｓｅ浓度,结果：辐照后ＧＳＨ－Ｐｘ和ＳＯＤ活性下降,ＭＤＡ含量升高,变化程度随微波辐照强度增大而增大,加亚硒     

雷公藤单体TZ93对人外周血单个核细胞表型的影响

研究雷公藤治疗系统性红斑狼疮的作用机制，以激活的正常外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）为细胞模型，应用 荧光激活细胞分类 仪（ＦＡＣＳ）分析以藤单体ＴＺ９３对ＰＢＭＣ细胞表型的影响。１０名正常女性的ＰＢＭＣ分成３组：Ｉ组ＰＢＭＣ，Ⅱ组ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ，Ⅲ且ＰＢＭ＋ＰＨＡ＋ＴＺ９３，分别加入鼠抗入ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＮＫ抗体。结果：ＦＡＣＳ显示ＴＺ９３能显著抑制激活的ＰＢＭＣ中ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２     

鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白和微孔蛋白诱导细胞免疫及免疫保护…

对鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白（ＯＭＰｓ）和微孔蛋白诱导ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠产生细胞免疫，即迟发型变态反应和白细胞介素２的能力进行了检测，并观察了用５００ＬＤ５０的鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌以腹腔途径攻击经ＯＭＰｓ，ｐｏｒｉｎ免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠所产生的主动免疫、交叉免疫和Ｔ细胞转移免疫保护的能力，发现：ＣＭＩ的能力，ＯＭＰｓ优于ｐｏｒｉｎ；而主动免疫保护率，交叉免疫保护率和Ｔ细胞转移免疫保护率均没有显     

环孢素A逆转人膀胱癌耐阿霉素细胞亚株BIU—87／ADM效应的研究

ＢＩＵ－８７敏感细胞和ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ细胞用环包素和柔红霉素处理后，采用３－（４，５）－双甲基－２０噻唑－（２，５）－二苯基溴化四氮唑蓝（ＭＴＴ）法评价细胞毒作用，荧光分光光度计检测细胞内ＤＮＲ聚集量。结果发现，ＣｓＡ能显著性增加ＤＮＲ对ＢＩＵ－８７／ＡＤＭ的细胞毒作用，逆转倍数为７．１倍，而对ＢＩＵ－８７敏感细胞的细胞毒作用增加不明显；ＣｓＡ与ＤＮＲ共同孵育２．５ｈ后能显著增加ＢＩＵ－８７／     

异种黑色素瘤相关抗原诱发抗肿瘤免疫伴发自身免疫性损伤

目的探讨腺病毒载体(Ad)介导异种黑色素瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)诱发抗肿瘤免疫与自身免疫性损伤的关系。方法用Ad编码的人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)皮内免疫C57BL/6小鼠,将小鼠分为正常对照组(d1703)、AdhTRP2和AdmTRP2免疫组。体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞内干扰素γ(IFNγ)染色(ICS)分析CTL杀伤活性和IFN-γ的产生(每组3只小鼠);皮下接种B16.F10黑色素瘤细胞(每组10只小鼠),观察荷瘤小鼠成活情况。结果AdhTRP2诱发小鼠CTL杀伤活性与免疫时间相关,免疫后1周活性达到最大,随后逐渐降低;AdhTRP2诱导的CTL杀伤活性具有剂量效应关系。AdhTRP2免疫小鼠1周其6hCTL杀伤率为94%±5%,脾脏产生IFNγ的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的0.87%±0.12%,而相应地AdmTRP2分别为22%±8%和0.15%±0.05%。接种1×106B16.F10细胞,AdhTRP2免疫的小鼠观察3个月100%无瘤生长,但在病毒注射部位有白癜风形成;而接种1×105B16.F10细胞的AdmTRP2免疫小鼠3个月只有20%的成活率,并不伴局部白癜风形成。结论用Ad介导异种TRP2能有效地打破对自身TRP2的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,同时伴发自身免疫性损伤。     

K-ras突变多肽负载树突状细胞诱导抗胰腺癌特异性免疫

目的 探讨K-ras(12-Val)突变多肽负载树突状细胞(DC),诱导胰腺癌特异性免疫的可行性.方法 采用未成熟Dc体外负载K-ras多肽(YKLVVVGAV)后诱导成熟,抗K-ras(12-Val)单抗检测突变抗原位点表达后与T淋巴细胞混合扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL),MTT法测定CTL对胰腺癌细胞和正常细胞的免疫杀伤活性.建市裸鼠胰腺癌移植瘤模型,分别予K-ras特异性CTL肿瘤瘤内及尾静脉注射,观察不同治疗途径对肿瘤生长的抑制效果.结果 负载K-ras(12-Val)多肽的DC成熟后表达突变抗原位点并有效地刺激自体[CD8+:(44.8±2.1)%]和同种异体T细胞活化;诱导的特异性CTL对胰腺癌细胞杀伤率按效靶比(10:1、20:1、50:1)分别为(21.2±1.9)%、(32.4±2.1)%、(45.7±5.3)%,杀伤效率均显著高于非特异性激活的T细胞治疗组(均P<0.05),对正常组织无损伤(均P>0.05).裸鼠K-ras特异性CTL治疗后8 d,瘤内治疗组肿瘤体积(68±13)mm3即明显低于对照组(87±14)mm3及IL-2非特异性治疗组(79±19)mm3(均P<0.05),K-ras特异性CTL治疗可以显著提高裸鼠的生存率(P<0.05).免疫组化染色证实K-ras特异性CTL具有体内迁移到肿瘤病灶的能力.结论 利用K-ras(12-Val)突变多肽体外负载树突状细胞,能诱导有效的抗胰腺癌特异性免疫反应.     

pcDNAL1 genetic immunization can induce specific cell-mediated immune respon ses in C57BL/6 mice

Objective To investigate the specific cell-mediated immune efficacy of the an HPV16 prophylactic vaccine. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups: experimental groupⅠ (treated with pcDNA L1), control group Ⅱ (treated with pcDNA3.1) and control group Ⅲ (treated with PBS buffer). The mice were immunized three times during a three-week interval. Ten to fourteen days after the third inoculation, a footpad swelling test was used to detect delayed-type hypersensitivity (DTH) responses. Antigen-specific splenocyte proliferation assay and quantitation of IFN-γ cells in splenocytes were performed by FACS assay. Results In the experimental group, splenocytes actively proliferated after stimulation with HPV16 VLP, and had developed a markedly larger amount of CD8(＋) IFN-γ(＋) cells, which is an index for special CTL. Also, the footpad was significantly thickened upon inoculation with HPV16 VLP.Conclusion Naked DNA vaccine of HPV16 L1 can induce specific cell-mediated immune responses in mice, which should be considered for evaluation of HPV16 DNA vaccine feasibility.     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

转移性体内迟发型超敏反应监测法的建立及临床应用

目的建立体内转移性迟发型超敏反应（Trans-vivo DTH）检测方法,用于评价临床移植受者的免疫状态。方法通过Ficoll密度梯度离心法获取供者和受者（各13例）外周血单个核细胞（PBMC）,用超声粉碎供者PBMC,制备供者亚细胞抗原。将受者的PBMC、回忆性抗原EBV抗原和供者抗原按以下各组分别注射入CB-17SCID小鼠的足垫：①阴性对照组：7～9×106个受者PBMC;②供者抗原反应组：7～9×106个受者PBMC＋10μg供者抗原;③阳性对照组：7～9×106个受者PBMC＋10μgEBV抗原;④连锁免疫抑制组：7～9×106个受者PBMC＋10μgEBV抗原＋10μg供者抗原。分别于注射前及注射24h后双盲测量小鼠的足垫厚度,计算两次测量厚度的差值。实验的有效性依据为阳性对照组足垫净厚度改变≥63.5×10-3mm。结果 13例亲属活体肾移植受者接受Trans-vivoDTH检测显示,致敏型8例（62%）,调节型3例（23%）,非调节型2例（15%）。结论 Trans-vivo DTH检测法可用于监测移植后受者对供者抗原的反应性。     

转移性体内迟发型超敏反应监测法的建立及临床应用

目的 建立体内转移性迟发型超敏反应(Trans-vivo DTH)检测方法,用于评价临床移植受者的免疫状态.方法 通过Ficoll密度梯度离心法获取供者和受者(各13例)外周血单个核细胞(PBMC),用超声粉碎供者PBMC,制备供者亚细胞抗原.将受者的PBMC、回忆性抗原EBV抗原和供者抗原按以下各组分别注射入CB-17 SCID小鼠的足垫:①阴性对照组:7~9×106个受者PBMC;②供者抗原反应组:7~9×106个受者PBMC+10 μg供者抗原;③阳性对照组:7~9×106个受者PBMC+10 μg EBV抗原;④连锁免疫抑制组:7~9×106个受者PBMC+10 μg EBV抗原+10 μg供者抗原.分别于注射前及注射24 h后双盲测量小鼠的足垫厚度,计算两次测量厚度的差值.实验的有效性依据为阳性对照组足垫净厚度改变≥63.5×10-3 mm.结果 13例亲属活体肾移植受者接受Trans-vivo DTH检测显示,致敏型8例(62%),调节型3例(23%),非调节型2例(15%).结论 Trans-vivo DTH检测法可用于监测移植后受者对供者抗原的反应性.     

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究

目的 观察乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答, 及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为3组, 于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒( pCMV,对照组2 )各3次.末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性.各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV 细胞作阴性对照.种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率.结果 pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组[(19.64±1.50)%]和pCMV组[(3.45±1.89)%](P＜0.05).荷瘤后10 d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P＜0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异.荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24 d,较两对照组均延迟了13 d,平均生存时间为(31±1) d,较两对照组延长(P＜0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P＜0.05), 两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义.结论 HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护.     

胆管癌肿瘤裂解物修饰和P53基因导入对树突状细胞免疫效应的影响

目的 :研究胆管癌裂解物对转染全长野生型P5 3的树突状细胞 (DC)免疫功能的影响。方法 :用腺病毒作为介质 ,将全长野生型P5 3转染入DC ,然后用胆管癌裂解物修饰已转染全长野生型P5 3的DC(LywtP5 3DC) ,检测这种DC表面分子B7 1、B7 2、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ表达的高低 ,诱导特异的细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)的能力 ,对小鼠的免疫保护和对动物模型治疗作用。结果 :经流式细胞仪检测胆管癌裂解物刺激的野生型P5 3DC表面高表达B7 1(86 .70 %± 0 .0 7% )、B7 2 (18.77%± 0 .0 8% )、MHC Ⅰ (87.2 0 %± 0 .0 5 % )、MHC Ⅱ (5 6 .70 %± 0 .0 7% ) ,单纯DC低表达 ;LywtP5 3DC能够特异性地杀伤胆管癌细胞 ,杀伤率为 81%。LywtP5 3DC治疗组和其它组在肿瘤生长的直径大小之间有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,在LywtP5 3DC治疗组中 ,肿瘤生长明显减慢。结论 :全长野生型P5 3基因转染 +胆管癌裂解物联合修饰的DC能诱导细胞毒性T淋巴细胞的特异性 ,显著地提高DC的抗原提呈功能 ,体外能诱导高效而特异的抗胆管癌免疫效应。     

尤文肉瘤融合基因修饰的重组腺病毒的构建及其转染的树突细胞体外抗尤文肉瘤免疫应答

目的:构建尤文肉瘤融合基因EWS-FLI1重组腺病毒,利用此腺病毒感染外周血单核细胞(PBMC),培养树突细胞(DC),检测感染后的DC致敏的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用.方法:将质粒Pec1/ EWS-FLI1酶切,切出的EWS-FLI1 cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack-cmv的hCMV启动子下游.将穿梭质粒和骨架质粒共同转化大肠杆菌BJ5183菌株,获得同源重组后的腺病毒质粒pADeasy-1/ EWS-FLI1.将此质粒转染293细胞,包装产生腺病毒Ad EWS-FLI1.扩增、纯化产生高滴度的Ad EWS-FLI1.转染PBMC并经过鉴定后致敏淋巴细胞,4 h 51Cr释放试验测定致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系的杀伤作用.结果: 同源重组后产生的pADeasy-1/ EWS-FLI1经PCR鉴定构建成功,纯化后的滴度为4×10¹⁰/mL.转染PBMC后,RT-PCR证实有EWS-FLI1 mRNA的转录.致敏后的淋巴细胞对尤文肉瘤细胞系有明显的杀伤作用,效靶比在40:1时,对尤文肉瘤673细胞系的杀伤率为35.1800%±0.0128%,和对照组相比差异有统计学意义. 结论 :重组腺病毒Ad EWS-FLI1构建成功,并能在PBMC中稳定有效地表达,Ad EWS-FLI1转染的DC可高效地诱发机体T细胞的特异性抗肿瘤免疫应答作用.