BJAB细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶的反义DNA后发生oncosis样死亡

目的：采用形态学和分子生物学方法,分析转导6A8α-甘露糖苷酶的反义DNA导致的B细胞株BJAB死亡的性质。方法：用Giemsa染色、annexin-V荧光染色、梯形DNA电泳以及透射电子显微镜等方法,分析细胞死亡的性质;应用ConA结合试验,检测转基因细胞6A8α－甘露糖苷酶活性的改变;应用Fluo-3探针测定细胞胞浆[Ca^2 ]i。结果：用重组腺相关病毒（rAAV)颗粒成功地将反义6A8DNA转导入了EB病毒转化的B细胞株BJAB。在克隆中,转导反义6A8 DNA的BJAB细胞在生长到3－10个细胞时死亡,而野生型、转导空载或转导正义6A8 DNA的BJAB细胞生长良好。转导反义6A8 DNA的BJAB细胞呈聚集状生长,且有大量细胞肿胀,最终死亡。Giemsa染色光镜观察、annexin-V荧光染色、梯形DNA电泳及透射电镜观察结果表明,这种死亡是一种oncosis(肿胀死）样死亡。ConA结合试验表明,BJAB细胞在转导反义6A8 DNA后的结合率升高,而转导正义6A8 DNA后的结合率则下降。另外,转导反义6A8 DNA的细胞胞浆[Ca^2 ]i升高。结论：转导反义6A8 DNA引起BJAB细胞发生oncosis样死亡,这种死亡可能与6A8α-甘露糖苷酶表达被抑制有关。     

爱泼斯坦-巴尔病毒操控鼻咽癌细胞HONE-1的miR-590-5p逃避免疫的机制研究

目的探讨爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)操控鼻咽癌细胞HONE-1的miR-590-5p以实现逃避免疫的机制研究.方法通过miRDB在线分析miR-590-5p与泛素E3连接酶(itchy E3 ubiq-uitin protein ligase,ITCH)的匹配情况,然后通过荧光素酶报告系统检测miR-590-5p是否靶向ITCH;使用miR-590-5p mimics过表达或者miR-590-5p inhibitor敲低miR-590-5p的情况下,通过免疫印迹检测ITCH与其底物MAVS的表达量,通过酶联免疫吸附试验检测鼻咽癌细胞HONE-1上清液中干扰素γ(interferon-γ,IFNγ)的表达量,同时检测EBV的复制情况.结果EBV感染鼻咽癌细胞HONE-1后miR-590-5p的表达量显著下降(P<0.05),并且miR-590-5p靶向ITCH的3′UTR.过表达miR-590-5p后,发现鼻咽癌细胞HONE-1的ITCH表达量降低,线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)泛素化水平下降,MAVS的表达量升高,IFNγ表达升高(P<0.05),EBV复制水平下降(P<0.05).敲低miR-590-5p后,发现鼻咽癌细胞HONE-1的ITCH表达量上升,MAVS泛素化水平上升,MAVS的表达量下降,IFNγ表达下降(P<0.05),EBV复制水平上升(P<0.05).过表达miR-590-5p的同时敲低MAVS或敲低miR-590-5p的同时过表达MAVS后,EBV病毒的复制没有明显差异(P>0.05).结论EBV通过抑制miR-590-5p的表达量以提高MAVS的泛素E3连接酶ITCH的表达量,降低鼻咽癌细胞HONE-1的IFNγ表达量,最终实现自身复制的增强.     

人B细胞C3d/EB病毒受体的部分cDNA克隆的鉴定:与C3b/C4b受体的同源性

人B细胞C3d/EBV受体即补体第二型受体(CR2),为一分子量为145000的糖蛋白,含有一分子量为110000的单条多肽链及8～11个N-连的寡糖。它在B淋巴细胞及脾脏的滤泡树突状细胞上表达。CR2可以识别C3的d区,也是人疱疹病毒EBV的膜受体,而EBV可以诱导B淋巴细胞的多克隆激活及永生化(immortalization),并伴发Bu-rkitt淋巴瘤及鼻咽癌。CR2在B细胞的生理性激活     

EBV转化技术中小鼠腹腔巨噬细胞的作用

EBV转化—融合技术是制备人单克隆抗体(McAb)的重要途径之一。但是,EBV转化技术的难点是在转化后,由于同时被EBV激活的特异性记忆T细胞的细胞毒作用,B细胞     

EB病毒和ConA诱导抑制性T细胞对EB病毒感染B细胞作用探讨

本文探讨了用灭活的EB病毒(EBV)和ConA诱导产生的抑制性T细胞(Ts),对EBV感染自身B细胞的影响,结果表明,EBV抗原诱导产生的抑制性T细胞(Ts)能使EBV感染B细胞中的EBNA阳性细胞数,~3H-TdR掺入量和IgA、IgG及IgM分泌量减少;而ConA诱导产生的Ts则使EBNA阳性细胞数和~3H-TdR掺入量增加,但三种Ig含量无明显变化(P>0.05)。结果提示前者对EBV感染B细胞的激活,增殖和分化均有明显抑制作用,而后者的作用则相反,具有明显促进EBV感染B细胞的作用。     

特异性CTL胞毒作用与HLA型别关系探讨

目的：探讨特异性CTL胞毒作用与靶细胞的HLA型别关系。方法：本实验以特定HLA型别，EB病毒转化的B淋巴母细胞（EBV－LCL）与同种异体单个核细胞（PBMC）混合培养，激活同种抗原特异性细胞性T细胞（CTL），观察其对携带不同HLA型别的EBV－LCL靶细胞的杀伤活性。结果：用EBV－LCL1致敏的效应细胞1对EBV－LCL2的杀伤效应比对EBV－LCL3强，用EBV－LCL2致敏的效应细胞2对EBV－LCL1的杀伤效应比对EBV－LCL3强，用EBV－LCL3致敏的效应细胞3对EBV－LCL1，2几乎无杀伤效应。结论：特异性CTL对不同HLA型别的靶细胞的胞毒作用存在差异，这不仅仅与HLA型别关联，而可能取决于抗原肽与MHC所组成的抗原综合信息。     

肺癌患者Th1/Th2状态及川芎嗪的调节作用

本研究采用RT PCR方法 ,以IFN γ和IL 2代表Th1型细胞因子 ,IL 4、IL 6、IL 10代表Th2型细胞因子 ,分别检测 3种肺癌细胞株 (鳞、腺、小细胞肺癌 )以及荷瘤机体外周血单个核细胞 (PBMC )Th1/Th2状态 ,并观察中药川芎嗪 (Tetram ethlpyrazine ,TTMP )的作用。结果显示 3种肺癌细胞株IFN γ和IL 2均无表达 ,而IL 4、IL 6、IL 10均表达 ;经川芎嗪培育后 ,3种肺癌细胞株均出现IFN γ的表达 ,而IL 4、IL 6的表达被抑制 ,小细胞肺癌株同时表达IL 2。肺癌患者PBMC中IL 4、IL 6和IL 10表达阳性率明显高于正常人 ,而IL 2无 1例表达 (0 / 2 3) ,IFN γ仅 1例表达 (1/ 2 3) ;与川芎嗪培养后 (两种浓度 ) ,肺癌患者IL 2 ,IFN γ的表达率明显提高 ;Th2型因子表达的优势状态较未加药组出现明显逆转。表明川芎嗪可促进肺癌细胞株和肺癌患者PBMC的Th2优势状态向Th1方向逆转     

激活的脐血树突状细胞对肿瘤细胞的直接杀伤作用

探索脐血树突状细胞 (DC)在γ干扰素 (IFN γ )及细菌脂多糖 (LPS )激活前后对肿瘤细胞杀伤活性的差异。分离健康脐血单核细胞 ,用重组粒单细胞集落刺激因子 (GM CSF )、白介素 4 (IL 4 )和α肿瘤坏死因子α (TNF α )诱导为DC。于诱导第11天在合成培养基中加入LPS或IFN γ继续培养 12h ,将其激活。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的改变 ,以明确LPS或IFN γ对DC的不同刺激作用 ;同时 ,以恶性血液病细胞株Jurkat及Daudi为靶细胞 ,以不同效靶比 (E∶T )与DC共同培养 18h ,采用51Cr释放试验检测DC激活前后抗肿瘤活性的差异。结果 (1)LPS及IFN γ可不同程度地上调DC表面CD86、CD80、CD83及CD1a的表达 ,尤以LPS刺激组明显 ;(2 )DC在未加刺激因子前能有效杀伤Jurkat细胞 ,在效靶比为 2 0∶1时 ,LPS或IFN γ可使其杀伤活性进一步提高至 5 0 0 %、 36 9% ,均与未加刺激因子前有显著差异 (P <0 0 0 1,P <0 0 2 5 ) ;(3)在效靶比为 2 0∶1时 ,LPS可使DC对Daudi的杀伤率提高至 19 8% (P <0 0 2 5 ) ,而未加刺激因子组及IFN γ刺激组DC对Daudi在任何效靶比均未显示明显的杀伤作用。LPS或IFN γ激活的脐血DC对Jurkat及Daudi细胞具有选择性杀伤作用     

6A8 α-甘露糖苷酶基因的mRNA表达与染色体定位

目的 对6A8α－甘露糖苷酶基因作染色体定位,比较6A8α－甘露糖苷酶mRNA在人多种免疫细胞株的表达。方法 用Fish原位杂交作染色体定位,用RT－PCR检测mRNA表达。结果 6A8α－甘露糖苷酶基因定位于人第13号染色体长臂的31－32区。6A8α－甘露糖苷酶mRNA在B细胞株SKW6高表达,在B细胞株3D5、BJAB、DESS、Daudi、Nalm6中度表达,在B细胞株Navalm,T细胞株GM、Jurkat,细胞细胞瘤细胞株U937弱表达,在T细胞株Peer,慢性髓性白血病细胞株K562极弱表达。结论 6A8α－甘露糖苷酶基因定位于人第13号染色体长臂的31－32区,其mRNA表达水平在各种人免疫细胞株不同。     

HIV-1感染相关细胞因子IFN-γ通过Rta基因启动子激活人类疱疹病毒8型

目的　研究HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ对人类疱疹病毒 8型 (HHV 8)Rta基因启动子活性影响 ;评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性。方法　将已构建的HHV 8Rta启动子 虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV 1Tat基因重组表达质粒转染多种细胞 ,转染后 2 4h加入IFN γ和 或重组HIV 1gp12 0刺激 ,刺激后 2 4h收集细胞 ,进行虫荧光素酶活性检测。试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照 ,进行最佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较。结果　①HHV 8Rta启动子启动活性在TPA刺激后的 2 4h达到最高峰 ;②HHV 8Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV 8和 或EBV基因组的存在 ,且在血管内皮细胞 (HUVECs)中启动活性最佳 ;③IFN γ可以诱导Rta启动子活性 ;但HIV 1Tat和gp12 0蛋白与IFN γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱。结论　HIV 1感染中相关细胞因子IFN γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV 8的复制     

新型低密度cDNA Macroarray的建立及其应用于干扰素抗HBV的研究

目的了解人肝胚瘤细胞株HepG2和稳定转染HBV全基因组细胞株HepG2.2.15的干扰素(IFN)抗病毒基因表达谱。方法选择与IFN抗病毒及其信号转导途径相关的288个IMAGE克隆,经聚合酶链反应(PCR)扩增相应的基因片段,将扩增的DNA片段纯化后点样于阳离子尼龙膜上以制备成人工芯片。HepG2和HepG2.2.15细胞经IFN处理后,分离细胞总RNA,进行逆转录并且同时以32P标记;将标记的cDNA靶基因与尼龙膜上的探针进行分子杂交。经Cyclone扫描系统和OptiQuantTM软件处理,将图像信号转换成数据信息;再经Excel软件分析、处理形成Macroarray数据值。结果Macroarray分析提示,在HepG2和HepG2.2.15细胞仅有部分IFN诱导基因表达,多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。通过比较HepG2和HepG2.2.15细胞,发现两者表达IFN诱导基因有差异,即对IFN应答有差异。进一步分析还发现,尽管与HepG2细胞存在差异的IFN应答,HepG2.2.15细胞的IFN信号转导途径(JakSTAT途径)却是开放的、未受损伤的。结论HepG2和HepG2.2.15细胞具有差异的IFN抗病毒基因表达谱。     

scFvCD20:sTRAIL蛋白诱导BJAB细胞凋亡的实验研究

研究融合蛋白scFvCD20:sTRAIL诱导B淋巴瘤细胞BJAB凋亡的发生以及凋亡相关蛋白的表达变化。采用PCR、重叠PCR、酶切、连接等方法构建pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP慢病毒表达载体,瞬时转染293T细胞获得含有scFvCD20:sTRAIL融合蛋白的细胞培养上清,采用CCK8细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL融合蛋白对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其对BJAB细胞诱导凋亡,Western blotting检测凋亡过程中内源性及外源性凋亡信号传导途径相关蛋白的变化。结果显示,成功构建了慢病毒表达载体pLentiR.scFvCD20:sTRAIL、pLentiR.ISZ-sTRAIL、pLentiR.scFvCD20及pLentiR.CopGFP,瞬时转染293T细胞后并可获得融合蛋白的表达。与ISZ-sTRAIL比较,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可不同程度地提高对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,凋亡细胞增多,其中Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3及PARP被特异性剪切活化。研究表明,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可诱导BJAB细胞凋亡,与bcl-2/bax的表达变化以及Caspase的剪切活化有关。     

EB病毒阳性T/NK细胞淋巴组织增殖性疾病的研究进展

Epstein-Barr病毒(EBV)属于疱疹病毒γ亚科,1964年由Epstein和Barr首次在Burkitt淋巴瘤细胞株中发现[1].EBV通过唾液传播,正常人群中感染率在90%以上,感染后终生携带EBV.EBV与多种疾病有关,有的仅有轻微症状,如同普通感冒;有的出现明显的全身性症状并呈自限性临床过程,如传染性单核细胞增多症(IM)[2];有的表现为长期反复发作的临床过程,并可进展为淋巴瘤,如慢性活动性EBV感染(CAEBV)[3];有的与肿瘤有明确关系,如Burkitt淋巴瘤、鼻型NK/T细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤等[1].     

内源性IL-12决定人PBMC产生干扰素γ的水平

目的：IFN－γ是由被有丝分裂原或抗原所激活的T细胞和NK细胞所产生,它具有广泛的免疫调节活性,现认为IL－12（外源性）是诱导IFN－γ产生的强诱导剂,并可促进静息CD4^ T细胞朝向Th1表型分化,即诱导细胞免疫。目的是为了解PBMC产生的内源性IL－12是否在体外可诱导IFN－γ的产生及通过何机制诱导细胞免疫。方法：用抗CD3抗体、PHA、抗CD3抗体加抗CD28抗体和抗原（MLC）来检测被刺激的PBMC细胞的IFN－γ的产生。同时也用IL－12和IL－12Rβ1的中和抗体来抑制IFN－γ的产生。结果：活的人PBMC中IFN－γ分泌依赖于内源性IL－12的产生,而且激活的T细胞可诱导APC细胞产生IL－2,此过程是通过T细胞表面的CD40L和APC的CD40相互作用而实现。结论：这些结果显示,内源性IL－12在正常罕主抗细胞内抗原的感染反应中起重要作用,在某些形式的自身免疫性疾病和移植排斥反应的免疫病理发生中也起中心作用。     

TPA和IFN-γ活化角朊细胞对T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的作用

角朊细胞激活对T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的作用。TPA和IFN γ联合作用 ,激活角朊细胞表达表面分子 ,FACS检测MHCI、II类分子和CD80、CD86分子水平 ,RT PCR检测B7 H1共刺激分子表达。由激活角朊细胞提供T淋巴细胞激活的第二信号 ;绵羊红细胞花环沉淀分离纯化T细胞 ,抗CD3单抗提供第一信号 ,建立体外混合培养系统 ,3 H TdR渗入法检测T细胞增殖 ,ELISA检测培养上清细胞因子浓度。结果显示 ,TPA和IFN γ联合作用可诱导角朊细胞表达B7 H1共刺激分子 ,并上调其MHCII类分子。以B7 H1为第二信号 ,可以协同抗CD3单抗对T细胞的增殖作用 ,并呈现独特的细胞因子分泌格局。因此角朊细胞激活后表达B7 H1共刺激分子 ,此第二信号可刺激T淋巴细胞增殖 ,对其功能分化具有调节作用     

EB病毒LMP2A特异性CTL的体外诱导及分析

用EBV LMP2A重组痘苗病毒 (rVV LMP2A )转染人树突状细胞 (DC ) ,转染后的DC分别在第 1、 7、 14天刺激相同MHC背景的T细胞 ,在IL 2作用下诱导LMP2A特异性CTL。用LDH释放法检测CTL杀伤活性 ;流式细胞术 (FACS )检测CTL诱导分化过程中CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 、CD5 6 + 等细胞的分群变化 ;RT PCR检测细胞分化过程中FasLmRNA表达 ;生物活性法检测功能性细胞因子IFN γ的分泌。结果显示本法诱导的CTL对靶细胞有特异性杀伤活性 ,第 2次和第 3次DC刺激后杀伤活性有所上升 ;在CTL诱导分化的第 7、 14、 2 1天细胞分群以CD4 + 、CD8+ 细胞为主 ;RT PCR证实所诱导的细胞内有FasLmRNA的表达 ;随细胞培养天数的增加IFN γ分泌增加 ,在第 14天达到较高水平。研究表明重组痘苗病毒载体rVV LMP2A转染的DC刺激T细胞可诱导出EBV LMP2A特异性CTL。     

Epstein—Barr病毒（EBV）及其介导的细胞永生化

Epstein-Barr病毒（EBV）因其与众多肿瘤的相关性以及其在体外能使B淋巴细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系（LCLs)的特性而成为近年来细胞永生化研究的热点之一。研究表明，EBV主要是通过其潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径而使细胞永生化的，但是病毒蛋白的具体作用机制尚无定论。本综述了EBV生物学特性方面近年来的研究成果，并以LCLs为切入点初步探讨了EBV介导的细胞永生化。     

IFNα高表达对视黄酸诱导HL-60细胞增殖、分化的影响

目的　探讨IFNα基因转移与ATRA对HL 6 0细胞增殖抑制和诱导分化的协同作用。方法　选择对视黄酸类药物比较敏感的HL 6 0细胞株作为实验对象 ,以逆转录病毒载体pLXSN IFNα5经PA317细胞包装后感染HL 6 0细胞 ,RT PCR检测有IFNαmRNA表达 ,用ELISA检测IFNα分泌量 ,再以 2 .5× 10 - 7mol LATRA处理转染和未转染细胞 ,用流式细胞仪和NBT还原实验观察细胞的增殖、分化情况。结果　逆转录病毒载体介导IFNα在HL 6 0细胞中高表达 ,2 4h 10 6 个细胞的分泌量为95ng mL ,ATRA对IFNα高表达的HL 6 0细胞的增殖抑制及诱导分化作用显著增强。结论　通过逆转录病毒载体介导使IFNα在HL 6 0细胞中高表达 ,ATRA与HL 6 0细胞中高表达的IFNα具有协同作用。     

Epstein-Barr病毒(EBV)及其介导的细胞永生化

Epstein- Barr病毒 (EBV)因其与众多肿瘤的相关性以及其在体外能使 B淋巴细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系 (L CL s)的特性而成为近年来细胞永生化研究的热点之一。研究表明 ,EBV主要是通过其潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径而使细胞永生化的 ,但是病毒蛋白的具体作用机制尚无定论。本文综述了 EBV生物学特性方面近年来的研究成果 ,并以 L CL s为切入点初步探讨了 EBV介导的细胞永生化。     

小鼠致瘤性CD_4~-CD_8~-早期T细胞在活化胞内双信号条件下可分泌IFN_γ

本室所建小鼠C_2早期T细胞株,是由内源性逆转录病毒转化的Thy-1~+CD_4~-CD_3~-的致瘤性不成熟T细胞。C_2细胞不能自发地分泌IFN_γ.以PMA+CaI(Ionomycin)活化胞内双信号,C_2细胞可分泌中等度活性的1FN_γ,其分泌能力比正常鼠胸腺皮质细胞群高8倍,但比胸腺髓质细胞群低约3倍.C_2细胞分泌IFN_γ较高可能与逆转录病毒转化相关,而早期T细胞分泌IFN_γ的证实,提示此类细胞可通过其分泌的因子诱导其自身的分化。