疏水层析法和凝胶过滤法分离HI47抗CD20 F(ab'''')2之比较

目的　比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化HI4 7抗CD2 0F(ab’) 2 的优缺点。方法　采用亲和层析柱protein G对发酵菌体裂解液进行粗纯化,分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD2 0F(ab’) 2 的分离纯化:疏水层析采用梯度洗脱,80 %B液洗脱2 0min ,10 0 %B液洗脱30min ;凝胶过滤以5 0mmol LPB缓冲液(pH 7.0 ) ,0 .8mL min洗脱4h。结果　粗纯化产物主要含F(ab’) 2 、Fab’,含量分别为19.6 %、5 9.7%。采用疏水层析法1h即可完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 7% ,纯度为89.3% ;凝胶过滤4h完成分离,F(ab’) 2 回收率为6 5 % ,纯度为90 .5 %。FACS结果表明,两者结合Raji细胞的阳性率分别为99.93%和99.97%。结论　疏水层析分离纯化抗CD2 0F(ab’) 2 简单、快速、回收率高、纯度高,适用于大规模的工业化生产。     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

鉴定单克隆抗体F(ab'''')2段及其结合物抗体活性方法的建立

鉴定单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的抗体活性通常采用免疫组化法或免疫印迹法。因为失去了Fc段，mAb的F（ab’）2片段的抗体活性不适合用常规免疫组化法或免疫印迹法进行鉴定。尤其是当鉴定mAbF（ab’）2段与其他蛋白质结合物的抗体活性时更为困难。我们用SPDP化学胶联法制备了抗人原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）的mAb HAb18的F（ab’）2段与超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）的结合物HAb18F（ab’）2-SEA，以用于肝癌导向免疫治疗的研究。为了鉴定HAb18F（ab’）2-SEA的抗肝癌抗体活性，本实验建立了用于鉴定mAbF（ab’）2及其结合物抗体活性的专用间接免疫组化法。     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的：构建抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ片段表达载体,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。结果：利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０单链抗体（ＳｃＦｖ）表达载体上扩增抗ＣＤ２０抗体轻链可变区基因（ＶＬ）、重链可变区基因（ＶＨ）,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ中,构建抗ＣＤ２０Ｆａｂ表达载体ｐＹＺＦ１ｃｄ２０,并在２７Ｃ７菌中高效表达。结果：经Ｆａｂ表达载体转化的２７Ｃ７菌株,进行表达培养,经分     

嵌合抗CD20抗体Fab片段在大肠杆菌中表达及活性鉴定

目的 :构建抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法 :利用PCR方法从抗CD2 0 单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0 抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,然后将VH、VL 基因重组到Fab表达载体pYZF中 ,构建抗CD2 0 Fab表达载体pYZF1cd2 0 ,并在 2 7C7菌中高效表这。结果 :经Fab表达载体转化的 2 7C7菌株 ,进行表达培养 ,经分离纯化获得具有CD2 0 特异结合活性的Fab片段 ,竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0 抗体HI47和CD2 0 表达细胞Raji细胞结合。结论 :在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD2 0 嵌合抗体Fab片段。     

SLE患者血清抗F(ab′)_2片段抗体的测定及其临床意义

用酶解法制备正常人 IgG-F(ab')_2片段及 SLE 患者血清抗 ds-DNA-F(ab')_2片段,ELISA 法检测同一组(46例)SLE 患者血清中抗 F(ab')_2片段抗体,两者检测结果呈高度相关性.同时发现,缓解期 SLE 患者血清中抗 F(ab')_2片段抗体水平明显高于活动期 SLE 患者,而抗 ds-DNA 抗体水平与之相反.提示,正常人 IgG-F(ab')_2片段与 SLE 患者血清抗 ds-DNA-F(ab')_2片段可能有共同的结构表位,其抗 F(ab')_2片段抗体测定可作为临床观察 SLE 活动性的一个指标.     

CD3／抗CD20双特异双链抗体生物学活性研究

目的 研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性。方法 采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用^3H-TdR掺入实验和^51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质。结果 纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3^ )和Daudi细胞（CD20^ )的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促进丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的自学成才性。结论 抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和H147相同的性质。且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体。     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

疏水层析法和凝胶过滤法分离H147抗CD20F（ab’）2之比较

目的比较疏水层析和凝胶过滤两种方法分离纯化H147抗CD20F(ab’)2的优缺点。方法采用亲和层析柱protein-G对发酵菌体裂解液进行粗纯化，分别采用疏水层析法和凝胶过滤法进行抗CD20F(ab’)2的分离纯化：疏水层析采用梯度洗脱，80％B液洗脱20min，100％B液洗脱30min；凝胶过滤以50mmol／L PB缓冲液(pH7．0)，0．8ml/min洗脱4h。结果粗纯化产物主要含F(ab’)2、Fab’，含量分别为19．6％、59．7％。采用疏水层析法1h即可完成分离，F(ab’)2回收率为67％，纯度为89．3％；凝胶过滤4h完成分离，F(ab’)2回收率为65％，纯度为90．5％。FACS结果表明，两者结合Raji细胞的阳性率分别为99．93％和99．97％。结论疏水层析分离纯化抗CD20 F(ab’)2简单、快速、回收率高、纯度高，适用于大规模的工业化生产。     

单克隆抗体及F(ab′)_2片段在小鼠体内的药物动力学研究

用~(125)I标记单克隆抗体(IgG2a)和相应片段F(ab′)_2,比较它们经静脉或腹腔不同途径注射后在小鼠体内的药物动力学变化。结果显示,同一种抗体形式(完整抗体或F(ab′)_2经iv或ip不同途径给药时,整体排泄率、血液清除率和生物半衰期等无明显差异(P>0.05);而相同途径给药时,完整抗体与F(ab′)_2比较,二者的Ke、T1/2、TBCL显著差异(P<0.05-0.01),完整抗体腹腔注射的生物利用度94％。提示:F(ab′)_2片段有利于改善肿瘤体内定位显象,腹腔注射是有效的给药途径。     

肝癌单克隆抗体HAb18及其F（ab′）_2、Fab片段在小鼠体内的药代动力学研究

作者对１３１Ｉ标记的抗人肝细胞癌单克隆抗体ＨＡｂ１８及Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ片段在小鼠体内的药代动力学进行研究。结果表明：（１）３种标记物的药代动力学模式有很大差异，完整抗体ＨＡｂ１８的清除过程符合开放一空模型，清除速率与注射剂量有关。按照剂量从高至低，其Ｔ１／２（整体排泄）分别为４８．０８ｈ、４２．６５ｈ、４０．５４ｈ；Ｔ１／２（血液清除）依次为６１．４２ｈ、４８．０７ｈ、４１．０３ｈ。（２）抗体片段的清除速率明显快于完整抗体，清除过程呈双相下降，符合二室模型。Ｆ（ａｂ′）。整体排泄的Ｔ１／２ａ为５．２９ｈ，Ｔ１／２β为３９．３７ｈ；血液清除的Ｔ１／２ａ为４．２０ｈ，Ｔ１／２β为３４．６１ｈ。Ｆａｂ片段整体排泄的Ｔ１／２ａ为３．５１ｈ，Ｔ１／２β为２０．２２ｈ；血液清除的Ｔ１／２ａ为１．３９ｈ，Ｔ１／２β为２４．３９ｈ。提示：完整抗体适用于肿瘤导向治疗，显像诊断则以抗体片段为佳。     

HI47（CD20）单克隆抗体对B细胞活化增殖的影响

CD_(20)单克隆抗体(HI_(47))能够抑制SAC诱导B细胞~3H-TdR掺入。进一步研究发现HI_(47)也能抑制SAC诱导B细胞~3H-UdR掺入和母细胞化,但对PHA和Anti-Ig引起的B细胞活化和T、B及髓细胞系的增殖无影响。用相同免疫球蛋白亚类的无关抗体及HI_(47)F(ab′)_2片段试验表明HI_(47)的抑制活性是抗体的特异性作用,与Fc片段无关。通过观察HI_(47)抗原表达与B细胞活化的关系,结果提示HI_(47)对SAC活化途径的抑制作用可能与CD_(20)抗原表达有关。     

FPLC纯化单克隆抗体（Fab＇）_2片段

作者采用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换色谱柱，在Ｗａｔｅｒｓ６５０Ｅ快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立了抗肝癌单克隆抗体（ＨＡｂ１８）Ｆ（ａｂ＇）２片段的快速纯化方法。该法是将ＭｃＡｂ用胃蛋白酶消化１８ｈ后，上阴离子交换色谱柱纯化，用ｐＨ７．５１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ洗脱，即得到纯化的Ｆ（ａｂ＇）２．一次纯化周期仅需２５ｍｉｎ，一次上样量１２０～１６０ｎｇ蛋白，Ｆ（ａｂ＇）２得率为３４％，回收率为５１％。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定纯度大于９５％，免疫荧光法测定活性为１：４０００．该法操作简单、快速、实用性强，不需要高档次的色谱仪，只要有一台核酸／蛋白检测仪便可进行纯化，是实验室纯化Ｆ（ａｂ＇）２的理想方法．     

131I-HAb18F(ab'')2在肝癌病人体内的生物学分布

24例原发性中晚期肝癌 ,用 L ugol氏液封闭甲状腺和肝胶体显像后 ,行肝动脉插管 ,经导管按 0 .5、0 .75、1.0 m Ci/ kg3个计量组给予 1 31 I- HAb18F(ab') 2 。给药后分别于 10、4 8、96、192 h再进行全身 SPECT动态显像 ,观察 1 31 I- HAb18F(ab') 2 在人体内的分布。结果显示肝癌组织中 1 31 I- HAb18F(ab') 2 明显高于其它脏器 ,且随时间延长而浓聚 ,正常肝组织和其它脏器内放射性浓聚无明显升高。研究说明 1 31 I- HAb18F(ab') 2 在人体内稳定性较好 ,与肝癌细胞能发生特异性牢固结合 ,是值得进一步研究的治疗肝癌的一类新药