小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻

目的 比较显微授精治疗周期中剩余的生发泡(GV)期不成熟卵母细胞的体外成熟培养及玻璃化冷冻效率.方法 将显微授精(ICSI)周期剩余的GV期卵母细胞随机分为3组:①在GV期玻璃化冷冻,解冻后进行体外成熟培养;②体外成熟培养至MII期后行玻璃化冷冻;③对照组:直接进行体外成熟培养(IVM).观察体外培养成熟卵母细胞及不同成熟阶段卵母细胞冷冻后的受精和发育潜力.结果 对照组的成熟率为71.6%(53/74),其中16枚行显微授精(ICSI),受精率为87.5%(14/16),卵裂率为85.7%(12/14),囊胚形成率为14.3%(1/7);组1与组2的存活率分别为97.5%(39/40)和87.5%(35/40),差异没有显著性;但是组1的成熟率28.2%(11/39)显著低于(P<0.01)对照组的成熟率71.6%(53/74);组2的受精率74.1%(20/27)与对照组的受精率87.5%(14/16)相比,差异没有显著性.结论 ICSI周期剩余的GV期卵母细胞能在体外培养成熟并具有良好的发育潜力,将GV期卵母细胞体外成熟培养至MⅡ期更适合于玻璃化冷冻保存.     

冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

目的探讨不同冷冻载体对小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻回收率、复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,以玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,分别以冷冻叶片（A）组、冷冻小钩（B）组、电镜铜环（C）组、自制冷冻叶片（D）组为冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞,通过对解冻后卵子回收率、复苏率、卵子受精率及早期胚胎发育率等分析判断冻存效果。结果回收率D组明显低于其他3组,差异有统计学意义（P〈0.01）;D组与其他3组卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胚胎受精率、继续发育潜能的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 4种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体,自制叶片组的卵子回收率明显低于其他3组,需更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。     

小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术

目的以小鼠卵母细胞为模型,利用开放式拉长细管(open pulled straw,OPS)法研究在不同条件下冷冻、解冻对其发育能力的影响,为家畜、濒危动物乃至人类探索一种简易、高效的卵母细胞冷冻保存提供理论与技术参考。方法在室温(25℃±0.5℃)条件下,以乙二醇(EG)、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液(EFS、EDFS),采用OPS法对卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。实验一:操作台温度分别为25℃±0.5℃和37℃±0.5℃时,卵母细胞在10%EG 10%DMSO或10%EG溶液中预处理30 s,移入EDFS或EFS中平衡15 s~45 s进行冷冻保存;实验二:操作台为37℃±0.5℃条件下,采用三种方法(卵母细胞在A:0.5 mol/L和0.3 mol/L的蔗糖中分别处理2 min和5 min;B:0.3 mol/L和0.15 mol/L的蔗糖中分别处理5 min和2 min;C:0.5 mol/L的蔗糖处理5 min)对EDFS30和EDFS40冷冻保存的卵母细胞进行解冻;实验三:解冻后的卵母细胞在SrCl2溶液中进行孤雌激活。结果与结论实验一中卵母细胞解冻后的形态正常率分别高达92.1%(25℃±0.5℃)和92.5%(37℃±0.5℃),均与对照组(98.9%)无显著性差异(P>0.05);实验二中卵母细胞解冻以C法效果最佳(形态正常率分别为92.5%和67.5%);实验三中解冻后在mCZB中培养0.5 h的卵母细胞激活效果优于未培养组(卵裂率和囊胚发育率分别为80.0%vs.57.7%;18.2%vs.0),均有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01);而培养组与新鲜对照组卵母细胞激活后卵裂率和桑椹胚发育率与对照组(80.0%vs.77.8%;52.8%vs.61.9%)均无显著性差异(P>0.05)。     

OPS法及自制冷冻叶法玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞的研究

目的:以小鼠为研究模型,建立优化的玻璃化冷冻卵母细胞方法以及研究超排卵对卵母细胞质量的影响,为人类卵母细胞玻璃化冷冻技术的改善提供基础研究依据.方法: 建立小鼠超排卵周期模型,比较ops(open pulled straw,开放式拉细麦管)和(自制)冷冻叶两种玻璃化冷冻方法冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞的复苏率及体外受精率.结果:超排卵周期组中(自制)冷冻叶法玻璃化冷冻卵母细胞复苏率为66.5%,高于OPS法的冷冻复苏率(45.2%),2者比较差异有统计学意义(P<0.05).(自制)冷冻叶法玻璃化冷冻卵母细胞冷冻后体外受精率为47.4%,高于OPS法的冷冻后体外受精率(32.9%),2者比较差异有统计学意义(P<0.05).结论:(自制)冷冻叶玻璃化法冷冻是小鼠MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的较优方法.     

3种玻璃化冷冻小鼠生发泡期卵母细胞效果比较

目的:比较3种玻璃化冷冻对小鼠生发泡期卵母细胞的存活及胚胎发育潜能的影响.方法:将小鼠生发泡期卵丘复合物(n=175、177、190)和裸卵(n=150、149、150)分别随机分为3组:采用一步乙二醇法、乙二醇加二甲基亚砜法、三步乙二醇法进行冷冻保存.解冻存活体外培养成熟后行卵胞浆内单精子显微注射受精,进一步评价胚胎发育潜能.结果:冻融小鼠生发泡期卵丘复合物,三步乙二醇法与一步乙二醇法的存活率、成熟率、受精率均高于乙二醇加二甲基亚砜组(P均<0.05);三步乙二醇法的优质胚胎和囊胚率均高于一步乙二醇法和乙二醇加二甲基亚砜法(P均<0.05).冻融小鼠生发泡期裸卵,三步乙二醇法的存活率及三步乙二醇法、一步乙二醇法的受精率及卵裂率均高于乙二醇加二甲基亚砜法(P均<0.05).三步乙二醇法中,卵丘复合物组的存活率、成熟率、受精率、卵裂率及优质胚胎率均高于裸卵组(P均<0.05).结论:3种玻璃化冷冻中,三步乙二醇法可以获得高质量的冻融小鼠生发泡期卵母细胞,是一种理想的冷冻方法;带完整卵丘颗粒细胞的生发泡期卵母细胞的冻融效果更佳.     

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

目的：通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ）,解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs 60.92%vs 69.93%,P〉0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs 96.19%,P〈0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P〈0.01）,且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs 31.34%,P〈0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组,差异均有显著性（28.57%vs 52.38%,P〈0.05;28.57%vs 57.14%,P〈0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs 26.67%,P〈0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好。     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

3种不同载体对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

目的以小鼠成熟卵母细胞(MⅡ期)为试验对象,应用3种不同载体对其行玻璃化冷冻,旨在分析载体对冷冻效果的影响。方法采用玻璃化冷冻技术冻存昆明种小鼠成熟卵母细胞,设新鲜对照组和玻璃化冷冻组,玻璃化冷冻组又分为开放式脉管(OPS)组、自制麦管组和Cryoleaf组。比较冻融后鼠卵的存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果新鲜对照组和玻璃化冷冻组的受精率、卵裂率差异无统计学意义,但囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05);OPS组与自制麦管组的鼠卵存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;OPS组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;自制麦管组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),而受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义。结论载体的不同会对卵母细胞玻璃化冷冻效果形成一定程度的影响。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔卵母细胞纺锤体的影响

目的:探讨玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体的影响.方法:以冷冻环为载体,单用乙二醇(ethylene glycol,EG)或乙二醇与二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)联合作冷冻保护剂,用直投液氮或使用玻璃化冷冻仪高速制冷冷冻家兔卵母细胞;解冻2 h后固定并免疫荧光法染色纺锤丝及染色体;用共聚焦扫描显微镜观察纺锤体形态.结果:在单用EG以及EG和DMSO联合直投液氮的方案中,纺锤体损伤较严重,但在EG和DMSO联合应用并采用玻璃化冷冻仪提高制冷速度的方案中,纺锤体形态正常的比例与对照组相似.结论:玻璃化冷冻方法中采用冷冻保护剂联合及采用玻璃化冷冻仪高速制冷对保持解冻后家兔卵母细胞纺锤体形态效果最好.     

EDS-40玻璃化冻存小鼠卵母细胞的研究

目的设计研究玻璃化液EDS一40对冻贮小鼠卵母细胞的效果。方法①按随机分组原则，分为实验组和对照组，实验组（a）采用自行设计的EDS一40玻璃化液进行玻璃化冷冻（其配方为：40％乙二醇＋18％葡聚糖），对照组（b）采用国际上已证实效果较好的EFS-40J~璃化溶液进行玻璃化冷冻，对照组（c）采用以PROH为基础的程序冷冻液进行程序冷冻。首先对EDS一40和EFS-40玻璃化溶液，行玻璃化测试；再随机选用小鼠卵母细胞，在室温25℃下分别加入EDS-40和EFS．40玻璃化溶液，玻璃化后装管并迅速投入液氮中。对照组（c）置于程序冷冻仪中进行程序化冷冻。各组均冻存2mo-3mo后，在25℃的水浴中复温后，用培养液反复洗涤后移入培养孔板培养，观察卵母细胞的成活率。将成活的卵母细胞行体外受精，观察其受精率。结果①两种玻璃化溶液能达到玻璃化效果；②EDS一40、EFS一40及对照组冷冻复温后的存活率依次为：79．34％、67．94％、56．34％；⑤EDS一40、EFS-40及对照组冻卵的受精率分别：79．17％、66．29％、51．25％。结论①EDS一40可以用来玻璃化冷冻小鼠卵母细胞；②EDS一40较EFS一40玻璃化溶液冻存小鼠卵母细胞效果更好；③玻璃化技术比传统冷冻法效果更好。     

小鼠卵巢玻璃化冻存不同时段FSH干预对Cx43表达的影响

目的通过在玻璃化冻存不同阶段给予小鼠卵巢组织促卵泡刺激素(FSH)干预,观察FSH对缝隙连接蛋白Connexin-43(Cx43)表达的影响,从而寻找最佳的FSH干预途径。方法将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢组织分为新鲜对照组(CG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、0.3 IU/mL FSH干预玻璃化冻存组,包括全程添加FSH组(OG-FSH)、冻存前添加FSH组(FG-FSH)以及冻存后添加FSH组(LG-FSH)。通过形态学、免疫组织化学技术及Western-blot技术观察并分析各组卵巢组织Cx43蛋白表达情况。结果正常卵泡百分比为玻璃化冻存数量最低,全称FSH干预玻璃化冻存组最高(P<0.05),全程添加FSH组(OG-FSH)最高,而其他组间正常卵泡百分比间的比较差异无统计学意义。各组间Cx43蛋白表达量从高到低,依次为全程添加FSH组(OG-FSH)、冻存前添加FSH组(FG-FSH)、冻存后添加FSH组(LG-FSH)、新鲜对照组(CG)、玻璃化冻存对照组(VCG),且差异有统计学意义(P<0.05)。结论玻璃化冻存全程添加FSH更有利于卵巢组织形态结构的保持以及Cx43蛋白的表达。     

人卵母细胞冻融的研究与应用

冷冻卵母细胞与冷冻胚胎对于治疗不孕症都具有重要价值.冷冻胚胎技术于1983年首次成功用于人类胚胎的保存[1].这些年来精子及胚胎冷冻已普遍用于生殖领域,但卵母细胞冷冻仍未在临床上广泛应用.1986年澳洲Chent2]首次报告卵母细胞冷冻合并体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer,IVF-ET)成功妊娠1例.目前这方面成功的经验仍不多.     

两组冷冻保护剂对卵裂期胚胎玻璃化冷冻效果的研究

目的：评价两组玻璃化冷冻保护剂对卵裂期胚胎的冷冻效果。方法以体外受精-胚胎移植周期患者受精后第3天废弃胚胎为实验对象,共102枚胚胎入选,随机分为乙二醇＋丙二醇（EG＋PROH）组52枚,乙二醇＋二甲基亚砜（EG＋DMSO）组50枚。比较观察两组玻璃化冷冻保护剂对卵裂期胚胎冷冻解冻后胚胎的复苏效果。结果玻璃化冻融后两组在复苏率上无显著差异,但在完整胚胎复苏率和卵裂球复苏率上EG＋PROH组显著高于EG＋DMSO组（P＜0.05）。结论对于卵裂期胚胎的玻璃化冷冻,选用EG＋PROH作为冷冻保护剂可取得较好的效果。     

EDS-40玻璃化液冻贮人2～8细胞胚胎效果的研究

目的:研究EDS-40玻璃化液冻贮人2-8细胞胚胎的效果.方法:将EDS-40与EFS-40玻璃化液对照进行研究,随机选用人2-8细胞胚胎,分别加入EDS-40及EFS-40玻璃化液处理后装管并迅速投入液氮中冻贮,均冻贮2-3个月后解冻复苏,观察胚胎存活率.结果:EDS-40玻璃化液冻贮人胚胎的存活率高于EFS-40玻璃化液(51.6%vs46.6%),但无明显统计学差异(p＞0.05).结论:EDS-40液是一种较好的新玻璃化液,其冻贮人胚胎后胚胎的复苏存活率高于经典的EFS-40液.     

三种玻璃化液对新生大鼠卵巢玻璃化冷冻效果的比较

目的 比较三种玻璃化液低温冻存新生大鼠卵巢的效果,为人卵巢组织冷冻的保护剂选择提供实验依据.方法 将36只出生1d的大鼠卵巢进行玻璃化冷冻,卵巢标本随机分为4组,新鲜对照组和EFS40、EG5.5、改良的EG5.5/30液冷冻实验组.分别通过光镜组织结构观察、荧光活力检测、TUNEL实验和免疫组织化学分析进行冷冻效果的比较.结果 EFS40、EG5.5、改良的EG5.5/30组冻融后存活卵泡的百分率低于新鲜对照组(P＜0.05);三种玻璃化液冷冻实验组卵泡凋亡率均高于新鲜对照组(P＜0.05);EFS40和EG5.5组,卵泡内Bcl-2阳性表达率较新鲜对照组下降(P＜0.05),Bax阳性表达率则较新鲜对照组上升(P＜0.05);改良的EG5.5/30组Bcl-2、Bax阳性表达率趋势与EFS40、EG5.5组相同,但均与新鲜对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 与EFS40、EG5.5液相比,改良的EG5.5/30液更适合新生大鼠卵巢的玻璃化冻存.     

Effect of Mouse Oocyte Vitrification on Mitochondrial Membrane Potential and Distribution简

The effects of mouse oocyte vitrification on mitochondrial membrane potential and distribution were explored in this study. The collected mouse oocytes were randomly divided into vitrification and control groups. Ethylene glycol（EG） and dimethylsulphoxide（DMSO） were used as cryoprotectants in the vitrification group. The mitochondrial function and distribution in the oocytes were examined by using the fluorescent probes, JC-1 and Mito Tracker green. The results showed that the ratio of red to green fluorescence in mouse oocytes was significantly decreased after thawing in the vitrification group as compared with the control group（1.28 vs. 1.70, P0.05）. The percentage of polarized distribution of the mitochondria in oocytes was conspicuously reduced in the vitrification group when compared with the control group（31% vs. 63%, P0.05）. It was suggested that vitrification significantly affects the mitochondrial function and distribution in oocytes and reduces the potential of oocyte fertilization and embryo development.