穿透支原体P35蛋白细胞粘附活性研究

目的研究穿透支原体（Mpe）P35蛋白的细胞粘附活性。方法IPTG诱导pQE31/p35原核表达载体在E.coli 中表达,用Ni-NTA Spin亲和纯化,Western blot鉴定表达产物。通过间接免疫荧光试验（IFA）、竞争抑制试验研究rP35对HeLa细胞的粘附活性。结果pQE31/p35在E.coli 中表达出分子量约35 kDa的蛋白质,Western blot鉴定其为特异性rP35蛋白。IFA发现rP35对HeLa细胞无明显的粘附活性;竞争抑制试验表明rP35不能抑制Mpe粘附HeLa细胞。结论P35可能不是Mpe的主要粘附分子。     

穿透支原体纤连蛋白结合蛋白的鉴定及分离纯化

目的 探讨穿透支原体对宿主细胞的黏附机制。方法 用去污剂Triton X-100提取穿透支原体蛋白，用配体免疫印迹试验鉴定纤连蛋白结合蛋白(FnBP)；然后制备纤连蛋白Sepharose 4B亲和柱，运用亲和层析技术从制备的样品中分离纯化FnBP，在非还原状态下进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果 配体免疫印迹试验鉴定出一65kDa的蛋白条带，可特异性地结合Fn；亲和层析技术得到相应的FnBP的纯化产物。结论 FnBP与穿透支原体对宿主细胞的黏附过程有关。     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定

目的：在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因,为实现肺炎支原体P1蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础。方法：PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因,并与pUC19载体DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株,X-Gal平板筛选转化子,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆。结果：PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因。结论：获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株。     

妇科炎症患者宫颈分泌物发酵支原体和穿透支原体的检测

目的探讨3种难培养支原体(发酵支原体,Mf;穿透支原体,Mpe;梨支原体,Mpi)的临床检测方法,同时了解其在温州地区妇科炎症患者中的感染情况。方法采集妇科炎症患者和正常女性(各280例)的宫颈管分泌物,接种于SP-4培养液培养。阳性培养物应用套式聚合酶链反应(nPCR)和DNA测序等方法加以鉴定。结果280例患者的宫颈分泌物中分离到8株Mf(2.86%)、7株Mpe(2.50%),而280例正常女性未分离到相应菌株。nPCR检测结果与之相符,阳性菌株经测序确认。结论培养液分离培养法结合nPCR技术,准确、较快速,是进行艾滋病(AIDS)相关支原体分离鉴定较可靠实用的方法。温州地区妇科炎症患者存在Mf、Mpe感染,在临床诊治中应予关注。     

P53蛋白在胃癌中的表达分析

目的探讨P53蛋白在胃癌中的表达。方法胃癌患者53例作为A组,胃炎患者53例作为B组,健康人士53例作为C组,均采用免疫组织化学法（S-P）检测P53阳性率。结果 A组P53阳性率为64.2%,B组为32.1%,C组为13.2%,组间比较差异有统计学意义（A、B：χ2=9.674,P〈0.01;A、C：χ2=26.888,P〈0.01;B、C：χ2=4.363,P〈0.05）。A组高分化癌P53阳性率为78.6%,低分化癌为48.0%,两者比较差异有统计学意义（χ2=4.120,P〈0.05）。B组浅表性胃炎P53阳性率为40.0%,萎缩性胃炎为21.7%,萎缩性胃炎P53阳性率高于浅表性胃炎,但差异无统计学意义（χ2=1.243,P〉0.05）。结论对胃病患者进行P53的早期检测,对监测病情和改善预后具有重要意义,值得临床考虑。     

P27蛋白在喉癌组织中的表达与临床意义

目的　探讨喉癌组织中P2 7蛋白表达的临床意义及其与细胞增殖和凋亡的关系。方法　运用免疫组化SABC方法及DNA末端标记法检测 5 9例喉鳞癌组织中P2 7与增殖细胞核抗原 (PCNA)的表达及原位细胞凋亡。结果　 5 9例喉鳞癌组织中P2 7蛋白表达与肿瘤临床分期、淋巴结转移、组织学分级及术后 5年生存率密切相关 (均为P <0 0 5 )。并且 ,P2 7低表达组中细胞增殖较高而凋亡较低 (P <0 0 5 )。结论　①P2 7蛋白在喉癌发生发展中起到一定的作用 ;②喉癌组织中P2 7蛋白的表达与细胞增殖和凋亡相关 ;③P2 7蛋白表达的减少和 (或 )缺失可用于喉癌恶性程度的判断和预后评价     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

P37蛋白在卵巢癌组织中的表达及意义

目的研究卵巢癌组织中P37蛋白的表达,探讨猪鼻支原体感染与卵巢癌发生的关系。方法采用免疫组化法检测109例卵巢癌组织和30例正常卵巢组织中的P37蛋白表达情况。结果卵巢癌组织中P37蛋白阳性表达率为43.1%(47/109),正常卵巢组织的阳性表达率为0(0/30),两者相比差异具有统计学意义(P<0.001)。结论卵巢癌组织中存在猪鼻支原体的感染,卵巢癌的发生与支原体感染有一定的相关性。     

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.     

溶脲脲原体单克隆抗体的制备和免疫学特性分析

目的：建立快速、灵敏及特异的检测溶脲脲原体免疫诊断方法。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术，制备单克隆抗体，并对其进行鉴定。结果：共获得7株能持续、稳定分泌抗支原体抗体的杂交瘤细胞系。单抗的类别4株为IgG1，3株为IgG2b。用ELISA法鉴定特异性良好。结论：制备的抗溶脲脲原体单克隆抗体特异性强、效价高。     

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的：重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scFv)的cDNA克隆，构建其表达载体，在原核系统中实现初步表达。方法：根据抗NI-35抗体的轻链重链序列，重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到克隆栽体pUC—18中，经全自动序列分析仪测序证实，再亚克隆至表达栽体pET-28a( )，转化大肠杆菌BL21，诱导表达。结果：合成的基因序列与设计的仅差一个碱基，目的基因连接方向及阅读框架正确；SDS-PAGE检测显示，表达出相对分子量31kDa的融合蛋白，并得到了良好的生物活性。结论：抗NI-35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达，为深入研究其应用于神经系统的损伤和修复奠定了基础。     

女性下生殖道炎症患者五种支原体的检测分析

目的:探讨女性下生殖道炎症患者发酵支原体(Mf)、穿通支原体(Mpe)、梨支原体(Mpi)、解脲脲原体(Uu)以及人型支原体(Mh)的感染情况,为临床诊治提供依据.方法:病例组(280例,其中宫颈炎120例,阴道炎100例,宫颈炎合并阴道炎60例)和对照组(280例)的宫颈或阴道分泌物,分别接种于改良SP-4和Uu、Mh培养基进行分离培养.培养阳性菌株采用生化反应试验、套式聚合酶链反应(nPCR)和核酸序列测定予以鉴定.结果:①病例组分离出阳性菌株144株(占51.43%),其中Mf8株(占2.86%),Mpe7株(占2.50%),Uu 75株(占26.79%),Mh54株(占19.29%),未分离出Mpi;对照组仅分离出5株Uu(占1.79%).系列鉴定结果与培养结果一致.②病例组与对照组在发酵支原体和穿通支原体的分离率上有统计学意义(P＜0.01).③宫颈炎组与阴道炎组间支原体的总分离率差异有显著性(P＜0.01).结论:女性下生殖道炎症与五种支原体感染有关;妇科炎症患者存在AIDS相关支原体感染,在临床诊治中应给予足够关注.     

支原体和衣原体检测及支原体对药物药敏分析

解脲支原体（Uu）、人型支原体（Mh）和衣原体（CT）感染会引起非淋菌性尿道炎（NGU）及下生殖道感染。近年来，该病发病率逐年增多，为了了解NGU感染和支原体的耐药情况，对感染患者进行诊断并选择敏感有效的药物治疗，对712例疑似NGU患者标本进行支原体培养鉴定和药敏检测，同时做衣原体检测。现将结果报告如下。     

鼻咽癌组织EBI3和p35蛋白的表达及临床意义

目的 检测EBI3、p35在鼻咽癌（NPC）组织中的表达水平,分析EBI3和p35在NPC发生发展中的作用及临床意义。方法 应用免疫组织化学方法检测50例NPC患者、30例癌旁黏膜和25例鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中EBI3和p35表达,并分析其与NPC患者临床分期、病理组织类型和淋巴结转移的关系。结果 NPC组织中EBI3高表达率为62.0%,显著高于癌旁黏膜组织中的36.7%（χ2=4.83,P〈0.05）和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%（χ2=4.53,P〈0.05）。T3～T4期NPC患者中EBI3高表达率显著高于T1～T2期患者（χ2=17.24,P〈0.01）;非角化型鳞癌NPC患者癌组织中EBI3高表达率显著高于角化型鳞癌患者（χ2=8.78,P〈0.01）;有颈部淋巴结转移NPC患者癌组织中EBI3高表达率显著高于无颈部淋巴结转移癌患者（χ2=14.49,P〈0.01）。p35高表达率为60.0%,显著高于癌旁黏膜组织中的33.3%（χ2=5.33,P〈0.05）和鼻咽黏膜慢性炎患者炎症组织中的36.0%（χ2=3.85,P〈0.05）。T3～T4期NPC患者中p35高表达率显著高于T1～T2期患者（χ2=19.28,P〈0.01）;非角化型鳞癌NPC患者癌组织中p35高表达率显著高于角化型鳞癌患者（χ2=7.24,P〈0.01）;有颈部淋巴结转移NPC患者癌组织中p35高表达率显著高于无颈部淋巴结转移癌患者（χ2=5.56,P〈0.05）。NPC组织中EBI3和p35表达之间呈正相关（r=0.328,P〈0.05）。结论 NPC组织中EBI3和p35高表达与鼻咽癌发生、发展相关,有望作为患者预后判断的重要标志物。