低分子量肝细胞生长素理化性质的研究

通过链霉蛋白酶P、N-糖苷酸F、O-糖苷酶、唾液酸酶水解低分子量肝细生长素,以探讨低分子量肝细胞生长素(HPN)的理化性质与生物活性。 一、材料与方法 1.材料:(1)低分子量肝细胞生长素(HPN):以乳猪肝脏为原料制备、纯化出的分子量约为6.54×10~3的耐热、促进肝细胞生长物质的纯品(研究所自行纯化)。(2)链霉蛋白酶P、NP40购自美国Sigma公司;N-糖苷酸F、唾液酸酶、O 糖苷酶购自美国Roche公司;~3H-TdR:购于北京中国原子能研究院,浓度为37×10~6Bq/ml,用前以RPMI1640培养基稀释,每10μl培养墓含37×10~3Bq~H-TdR。其余试剂购自北方同正公司和重庆医药有限公司试剂部。(3)QGY细胞由重庆医科大学病毒性肝炎研究所提供。     

VEGF165核酶对裸鼠人肺腺癌的治疗作用

本研究设计合成针对血管内皮生长因子 165 (ＶＥＧＦ16 5)2 12位点的锤头状核酶及其突变体 ,构建其腺病毒真核表达载体 ,并转染人肺腺癌细胞Ａ5 49,观察核酶对肿瘤细胞生物学特性和ＶＥＧＦ16 5表达的影响及其对肿瘤生长的抑制作用。材料与方法　主要试剂和动物 :胎牛血清、脂质体和ＤＭＥＭ及ＴＲＩｚｏｌＲＮＡ提取试剂 (美国Ｇｉｂｃｏ公司 ) ,各种工具酶和试剂盒 (美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司 ) ,ＶＥＧＦ16 5单抗和ＣＤ34 单抗(瑞典Ｄａｋｏ公司 ) ,[α 32 Ｐ]ＵＴＰ购自北京亚辉公司 ,裸鼠购自第四军医大学动物中心。质粒 :ｐＧＥＭ3Ｚｆ(…     

系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶在糖尿病肾病发病中的作用

蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ)在糖尿病肾病发病中的作用已受到广泛重视和研究〔1〕。本研究采用免疫组化和激光共聚焦显微镜技术 ,观察丝裂原活化蛋白激酶 (ＭＡＰＫ)在糖尿病大鼠肾脏中的表达和作用 ,并探讨其激活机制。一、材料和方法1.试剂和仪器 :链脲佐菌素 (ＳＴＺ)、血管紧张素Ⅱ (ＡｎｇⅡ )购自Ｓｉｇｍａ公司 ,ｐ4 2ＭＡＰＫ抗体购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司 ,激光共聚焦显微镜购自美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司 (10 2 4型 )。2 .糖尿病大鼠模型的建立和ＭＡＰＫ在肾脏的表达 :将Ｗｉｓｔａｒ大鼠分成糖尿病组和对照组 ,ＳＴＺ复制糖尿病模型 ,喂养…     

骨形态发生蛋白2和4在外源性Noggin模型大鼠再生肝的表达及其意义

骨形态发生蛋白(BMPs)信号转导通路是肝再生过程中重要的信号转导通路[1].本研究通过外源性Noggin的干预,探讨BMP-2和BMP-4对大鼠肝大部切除(partial hepatectomy,PH)后肝再生过程的影响. 一、材料与方法 1. 材料:外源性Noggin试剂盒购于美国R&DSystems,Inc.试剂公司,兔抗鼠BMP-2多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色剂均购自武汉博士德生物有限公司.兔抗鼠BMP-4多克隆抗体、即用型SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司.大鼠BMP-2定量酶联检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司.     

细胞信号转导抑制剂对日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2免疫偏移的调控

目的　观察酪氨酸蛋白激酶 (TPK)、蛋白激酶 C(PKC)和磷酯酰肌醇 - 3-激酶 (PI- 3K)特异性抑制剂(Tyrphostin- 2 5、D- sphingosine和 Wortmannin)分别特异性抑制 TPK、PKC和 PI- 3K后 ,对小鼠脾 CD4 + T淋巴细胞经虫卵可溶性抗原 (SEA)诱生 IFN- γ和 IL- 4的表达水平及对 Th1/Th2免疫偏移的影响。　方法　分别于小鼠感染日本血吸虫后 0、4、8和 12周 ,用单克隆抗体分离脾 CD4 + T淋巴细胞体外培养 ,并进行细胞信号转导抑制试验 ,用 EL ISA夹心法和硝酸还原酶法分别测定小鼠脾 CD4 + T淋巴细胞体外培养上清 IFN-γ、IL - 4和一氧化氮 (NO)表达水平。　结果　Tyrphostin- 2 5对 IFN-γ和 IL - 4水平的抑制作用均非常显著 (P<0 .0 1) ,D- sphingosine主要影响 IL - 4的表达 (P<0 .0 1) ,而 Wortmannin则主要影响 IFN-γ的表达 (P<0 .0 1) ,对反映 Th1/Th2免疫平衡的 Th2分化指数分析表明 ,D-sphingosine可使 Th2免疫应答优势减弱 ,而 Wortmannin则可使 Th2免疫应答优势增强。对脾 CD4 + T淋巴细胞培养上清 NO水平检测结果显示 ,NO水平动态与 IFN-γ相一致 ,NO水平主要受 TPK抑制剂 Tyrphostin- 2 5和 PI- 3K抑制剂Wortmaninn的影响 ,结合该两种信号分子抑制剂对 Th1/Th2细胞因子表达水平的作用结果分析 ,     

复方苦味叶下珠对小鼠急性肝损伤的防护作用

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物:NIH品系小鼠,体重20±2g,由卫生部兰州生物制品研究所供应。 1.1.2 试剂:四氯化碳(CCl_4),分析纯,北京化学试剂公司,批号941020。D-GalN,购自Sigma Chemi-cal Co。临用前用生理盐水配成10％溶液,并用1mol/L氢氧化钠调节pH值至7.0。 1.1.3 药物:FKZ(原名复方虫草珍珠胶囊)系我     

肝细胞内游离钙分布及钙振荡的亚细胞特征

应用拟肾上腺素类药物去氧肾上腺素来刺激α受体,观察盯细胞内游离钙分布及钙振荡的动态变化,以明确肝细胞内游离钙分布及钙振荡的特征。 1.材料与方法:(1)试剂:去氧肾上腺素终浓度10μmol/L,购自上海化学试剂公刊,DMEM培养基购自美国Gibco公司,小牛血清购自本校传染病中心,Fluo-3/AM、F-127均购自美国Sigma公司。(2)细胞培养:人肝细胞分离按照我中心实验室常规方法分离培养。肝细胞用DMEM培养基加小牛血清常规培养。(3)仪器:激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司),激光     

cag致病岛在幽门螺杆菌致病与免疫防治中的作用

细胞毒素相关基因蛋白致病岛 (cagPAI)在幽门螺杆菌(Hp)致病与免疫防治中的作用存在争议 ,本研究应用 3对cagPAI野生株与cagPAI基因“敲除”(knockout)的突变株对此进行了研究。一、材料与方法1.材料 :重组霍乱毒素 (CT) ,PKH2 6、PMA和Iono mycin购自美国Sigma公司。ELISA检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。其他试剂为国产分析纯。实验中共应用 3对cagA阳性野生菌株及其对应的cagA致病岛(PAI)“敲除”突变株 ,均由美国德克萨斯大学PeterBErnst教授惠赠。所用菌株见表 1。Hp悉尼株 (SS1)、胃上皮细胞系Kato Ⅲ系…     

噬菌体生物扩增法检测痰标本结核分枝杆菌及耐药性测定

目前常规结核分枝杆菌(MTB)细菌学检查和药敏检测尚无法充分满足临床需要。以噬菌体为基础的结核分枝杆菌裂解试验,利用噬菌体生长快、特异性高的特性,快速准确地检测MTB,并进行药敏检测,近年来在结核病研究中备受关注[1-2]。本研究采用噬菌体裂解法快速检测肺结核患者痰标本中的MTB,同时检测对异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)的敏感性,并与改良罗氏培养法分离细菌及比例法药敏结果进行比较,现报告如下。材料与方法一、材料1.标本来源:70份涂阳痰标本均取自我院结防门诊部2005、2006年临床确诊的肺结核患者。2.噬菌体生物扩增法(PhaB)检测试剂由上海金浩公司提供。3.指示细胞:购自国家菌种保藏中心。为快速生长的耻垢分枝杆菌。用液体培养基将处于对数生长期的耻垢分枝杆菌调至工作浓度为109菌落形成单位,4℃保存备用。4.药物及其浓度:R、H、E粉购自沈阳红旗制药厂,S购自上海信谊药厂。4种药物的试验浓度分别为:H0.4μg/ml、R 20μg/mlS、5μg/ml、E 5μg/ml。二、方法1.标本前处理:70份涂片阳性肺结核患者痰标本用4%的氢氧化钠-半胱氨酸37℃水浴震荡液化20 min...     

Apo2.7抗体标记法原位检测细胞凋亡

探讨利用免疫细胞化学方法代替流式细胞仪原位检测细胞凋亡的可行性。 1.材料:(1)细胞株:HepG2细胞系高度分化的肝癌细胞株,生物学特性与正常肝细胞相近,用于建立体外肝细胞凋亡的模型。(2)试剂:鼠抗人Apo2.7抗体:购自美国Coulter公司。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG:购自北京中山生物技术有限公司。免疫组织化学试剂盒:购自福州迈新生物公司。 2.方法:(1)乙醇诱导HepG2细胞凋亡模型的建立:HepG2     

醛脱氢酶基因转移介导的环磷酰胺耐受性研究

醛脱氢酶基因 (ＡＬＤＨ1)能氧化环磷酰胺 (ＣＴＸ)的中间代谢产物醛磷酰胺 ,形成无毒的羧基磷酰胺 ,发挥对ＣＴＸ的解毒作用。我们利用逆转录病毒介导ＡＬＤＨ1转染人造血细胞系Ｋ5 6 2 ,体外实验观察ＡＬＤＨ1基因转移过表达与ＣＴＸ耐受程度间的关系。一、材料和方法1.主要试剂 :Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂购自ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ公司 ;4 氢过氧化ＣＴＸ(4 ＨＣ)由美国Ｄｕｋｅ大学癌症研究中心ＳｕｓａｎＬｕｄｅｍａｎ博士惠赠 ;Ｇ4 18、总ＲＮＡ试剂ＴＲＩｚｏｌ、Ｍ ＭＬＶ逆转录酶为ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ…     

牛膝多糖对幼年哮喘大鼠模型气道炎症的影响

支气管哮喘 (简称哮喘 )的主要特点是气道高反应性、慢性嗜酸粒细胞 (EOS)性肺部炎症以及气道黏液的过度分泌、Th1/Th2淋巴细胞比例和功能失调[1]。牛膝多糖 (ABPS)是我国传统中药牛膝根中提炼出来的有效成分 ,具有免疫调节作用[2 ]。我们采用幼年SD大鼠哮喘模型 ,探讨ABPS对哮喘气道炎症及Th1/Th2平衡的作用及机制。材料与方法　ABPS为白色结晶粉末 ,纯度为 99 9% ,购自中国科学院上海有机化学研究所 ,鸡卵清白蛋白 (OVA)购自美国Worthington公司 ,白细胞介素 4(IL 4)、γ干扰素 (INF γ)试剂盒购自美国R&D公司。哮喘模型复制…     

亚精胺对心肌梗死大鼠心肌线粒体功能及细胞凋亡的影响

目的:探讨亚精胺对心肌梗死大鼠心肌线粒体功能及细胞凋亡的影响。方法:选取健康SD大鼠32只,随机分为假手术组、模型组、模型+阿司匹林组、模型+亚精胺组,每组8只,利用在体结扎冠状动脉前降支法建立急性心肌梗死模型。造模成功后假手术组和模型组给予无菌生理盐水(2 mL)灌胃,模型+阿司匹林组以等体积阿司匹林(20 mg/kg)灌胃,模型+亚精胺组以等体积亚精胺(5 mmol/L)灌胃,连续4周。TTC染色、HE染色观察心肌组织梗死面积和病理学改变;透射电镜观察心肌线粒体形态;原位缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌组织细胞凋亡水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的mRNA表达水平;Western blot检测Bcl-2、Bax、caspase-3、细胞色素C(cytochrome C)的蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织梗死区面积增加,心肌组织细胞凋亡明显增加,心肌组织Bax、caspase-3、cytochrome C表达水平明显升高,Bcl-2表达水平明显降低(P均<0.01);与模型组比较,模型+亚精胺组大鼠心肌组织梗死区面积减少,心肌组织细胞凋亡及Bax、caspase-3、cytochrome C表达水平均明显减少(P<均0.05);与模型+阿司匹林组比较,模型+亚精胺组心肌组织细胞凋亡明显降低(P<0.01),两组心肌组织Bax、caspase-3、Bcl-2、cytochrome C表达水平的差异无统计学意义。结论:亚精胺可改善心肌线粒体功能,抑制细胞凋亡,改善心肌梗死。     

大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中游离脂肪酸的作用

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是隐源性肝硬变的重要前期病变。然而,目前对日益高发的非酒精性脂肪肝如何发展为脂肪性肝炎仍不甚清楚。为此,我们通过高脂饮食建立脂肪性肝炎模型,旨在从游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的角度探讨NASH的发病机制。 1 材料和方法 1.1 材料健康成熟雄性Spraque-Dawley(SD)大鼠(清洁级)19只,体质量140g～160g,购自西普尔-必凯动物有限公司。FFA试剂盒购自执诚公司的Randox试剂。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒购自南京聚力生物医学工程医学工程研究所。细胞色素     

雌激素减弱氧化低密度脂蛋白的细胞毒作用

一、材料与方法　　我们于 1 998年 2～ 8月参照已有的方法 〔1〕,提取人血低密度脂蛋白并作修饰和鉴定。取在我院妇产科出生 4 h内的婴儿脐静脉内皮细胞作原代培养 ,实验用生长稳定的第 3～5代细胞。当细胞生长至 1 0 6 个 /瓶时 ,随机分成 3组实验。雌二醇 ( 1 7β-estrodiol,E2 )组 :E2 购自美国 Sigma公司 ,终浓度分别为 1 0 - 5、1 0 - 7、1 0 - 9mol/L;孕酮组 :孕酮购自美国 Sigma公司 ,终浓度分别为 1 0 - 5 、1 0 - 7、1 0 - 9mol/L;对照组 :含乙醇 1 0 - 2mol/L。　　 1 .E2 组、孕酮组细胞分别用含 E2 或孕酮的无酚红DMEM培…     

不需酚抽提的DNA提取方法的建立

１材料和方法１．１材料石蜡包埋组织（大肠癌组织）为近年来本院普外科手术切除标本,应用１０％中性福尔马林固定,常规石蜡包埋．ＰＣＲ扩增仪购自美国Ｅｌｍｅｒｋｉｎ公司,Ｔａｑ酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司,蛋白酶Ｋ购自德国Ｍｅｒｃｋ公司．１．２方法１．２．１Ｄ...     

用酵母双杂交系统筛选人肝再生增强因子的相互作用蛋白

采用酵母双杂交系统,寻找人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白,探讨hALR在肝再生过程中的分子生物学机制。 1.材料与方法:(1)主要材料:MATCHMAKER双杂交系统3试剂盒、预转化人肝脏cDNA文库、YEASTMAKERTM酵母转化系统、YEASTMAKERTM酵母质粒分离试剂盒、酵母菌培养基、X-α-Gal等均购自美国Clontech公司。(2)“诱饵”质粒的构建及鉴定:用RT-PCR技术从水囊引产的4月龄人胎肝     

大鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤血清F蛋白的动态观察

1 材料与方法 1.1 材料 动物:健康Wistar大鼠15只,体重150～200g,雄性,购自同济医科大学实验动物中心。主要试剂:D-氨基半乳糖(D-GlaN),购自北京科技协作中心精细化学部,卫生盐水溶解pH～7.0,最终浓度为100g/L。谷丙转氨酶(ALT)试剂盒,北京化工厂产品,批号960422。血清F蛋白检测试剂,由中国医科院放射医学研究所提供。     

缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对肺癌细胞生长的抑制作用

恶性肿瘤在生长过程中 ,由于组织增生过快必然会造成局部组织缺氧和供能与耗能之间的不平衡[1] 。缺氧诱导因子 1(hypoxia induciblefactor 1,HIF 1)能通过诱导血管内皮生长因子 (VEGF)和糖酵解相关酶的表达 ,增加供血、供氧、供能 ,改善这一失衡 ,与肿瘤的发生、发展密切相关[2 ] 。本研究拟设计HIF 1α的反义寡核苷酸 ,并研究它对体内、外肺癌细胞株A5 4 9的抑瘤效应 ,为肺癌的基因治疗寻找一条可行的途径。材料与方法　细胞株与试剂 :肺癌细胞株A5 4 9购自武汉大学典型生物保藏中心 ;脂质体lipofect2 0 0 0和新生牛血清购自Gibcol…     

从1例慢性乙型肝炎患者治疗过程分析慢性乙型肝炎的治疗策略

一、病例 患者男,47岁.从1981-2003年因ALT升高、HBsAg(+),HBeAg(+)、抗-HBc(+)在本院诊断为病毒性乙型肝炎.患者共住院治疗4次,住院期间先后给予一般保肝药物治疗、聚肌胞治疗,1997年肝功能正常且排除肝硬化后开始用干扰素(IFN)抗病毒治疗.给予基因工程干扰素α-2b(购自美国先灵葆雅公司)3 MU,隔天1次;2003年,改用注射用重组人干扰素α-2b(购自深圳海王英特尼公司)3 MU,隔天1次.