Ti和Ri质粒对栝楼双转化的研究

目的 :建立栝楼双转化毛状根培养系统。方法 :①利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株C58感染栝楼Trichosanthes kirilowii.无菌苗诱导冠瘿瘤 ,然后用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes菌株 15834感染其再生植株 ,诱导出毛状根 ;②用纸电泳检测Ti和Ri质粒是否转化成功 ;③运用分光光度计和SDS PAGE检测栝楼组织中所含蛋白。结果 :Ti和Ri质粒转化成功并建立了栝楼双转化毛状根培养系统。结论 :双转化毛状根与一般毛状根相比 ,具有生长更迅速等特点而蛋白含量基本一样 ;因此 ,利用它来生产天花粉蛋白更具有开发潜力。     

RiT-DNA对四倍体菘蓝的遗传转化及其植株再生

目的：建立一套利用发根农杆菌转化四倍体菘蓝的有效方法。方法：利用发根农杆菌R1601,ASTCC15834和A4感染四倍体菘蓝的子叶外植体诱导出毛状根,再将毛状根置于含不同激素的培养基上诱导再生植株。结果：3种农杆菌具有不同的诱导能力,毛状根在不含激素的MS固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状：多分枝、多根毛且无向地性,经冠瘿碱分析证明确已被转化。毛状根在无激素的MS增养基中悬浮培养两周后其生物量增加近35倍,在含BA的MS固体培养基上不经愈伤组织阶段直接分化出不定芽,所有不定芽都可在生根培养基上生根长成再生植株。冠瘿碱检测表明Ri质粒的T-DNA部分已转化到再生植株基因组中。结论：发根农杆菌可以诱导四倍体菘蓝长出毛状根,经诱导出的毛状根具有再生完整植株的能力。     

四倍体菘蓝毛状根的培养及其抗内毒素成分分析

 目的 从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根并探讨用毛状根培养来大规模生产有用的药用植物次生代谢物的可能性。方法 利用发根农杆菌A4菌株对四倍体菘蓝进行感染,采用高效毛细管电泳法同时测定诱导出的毛状根中具有抗内毒素作用的五种有机酸［邻氨基苯甲酸、水杨酸、丁香酸、苯甲酸、3-(2-苯甲酸)-4(3H)-喹唑酮］的含量。结果 A4菌株从四倍体菘蓝诱导出毛状根,且毛状根含有原植物中具有抗内毒素作用的五种有机酸。结论 发根农杆菌能诱导四倍体植物产生毛状根,我们有可能利用毛状根培养来生产有价值的植物次生代谢物。     

川黄柏高效遗传转化系统建立和植株再生研究

目的:建立发根农杆菌高频转化川黄柏的有效方法。方法:利用发根农杆菌R1601转化川黄柏带子叶下胚轴,并将获得的毛状根,置于含不同生长调节物质配比的培养基上诱导产生再生植株。结果:建立的高频转化系统为选择生长10 d的川黄柏带子叶下胚轴,经过36 h的预培养,农杆菌菌液(OD600=0.6)浸染15 m in、共培养4d,浸染菌液最佳配制方法是在菌液培养阶段添加60μmol/L的乙酰丁香酮。经PCR检测证明发根农杆菌R i质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏毛状根和再生植株的基因组。结论:通过改善转化条件,发根农杆菌R1601可以高效诱导川黄柏长出毛状根,并具有进一步再生完整植株的能力。     

药用植物毛状根的诱导及其应用

植物毛状根培养是植物组织培养中的一种,因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足,且具有不依赖外源植物激素等优点,近年来研究较多。文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况,并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用,旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。     

丹参CYP76AH1转基因毛状根的建立及其蛋白的分离

蛋白质复合物参与植物多种次生代谢物的合成,其分离对阐明植物次生代谢及提高体外催化效率至关重要。该研究构建了过表达丹参酮合成途径关键酶CYP76AH1的转基因毛状根株系,通过Western杂交筛选得到高表达CYP76AH1蛋白的丹参转基因毛状根,并以此作为后续提取丹参酮合成途径中蛋白质复合物的组培材料。通过优化蛋白提取缓冲液中的去污剂种类和浓度,筛选出含0.5%Triton X-100的缓冲液为最佳提取缓冲液,并分离得到相对大量的可溶性CYP76AH1蛋白质。该研究为后续进一步分离纯化与CYP76AH1相互作用的蛋白质复合物奠定了基础,也为深度解析丹参酮合成代谢通路提供思路。     

植物表达载体在三分三发根中的高效表达

目的建立基于发根培养的三分三Anisodus acutangulus遗传转化体系及在三分三发根中表达外源基因的方法。方法由种子直接萌发得到无菌苗,建立了三分三的无菌苗培养系统。将植物高效表达载体pCAMBI-A1304 导入经过“disarmed”改造的根癌农杆菌C58C1(携带pRiA4质粒),获得了携带外源基因表达载体的重组C58C1工程菌。取生长良好的幼嫩真叶作为外植体,在乙酰丁香酮的诱导下用重组C58C1进行感染,诱导发根。选取在无激素培养基上生长迅速,分支多的发根单克隆进行继代培养。经过3次继代培养,PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)检测用于验证发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIA1304 是否整合到三分三发根基因组内。结果建立了基于发根培养的三分三遗传转化体系,发根诱导频率达到100%,PCR检测表明pRiA4和pCAMBIA1304 质粒共转化率达到32%。结论该方法可以用于在三分三发根中高效表达外源基因,为实现基于发根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定了基础。     

川黄柏毛状根的诱导及活性成分的产生

目的：诱导川黄柏毛状根的发生。方法：利用发根农杆菌ATCC15834,A4,R1600和R1000诱导川黄柏不同外植体产生毛状根。结果与结论：经PCR扩增实验证实发根农杆菌Ri质粒的T-DNA片段已整合进入川黄柏植物核基因组中,HPLC测定结果显示,川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱,并且其含量高于川黄柏组培苗和愈伤组织。     

转基因何首乌毛状根生物转化青蒿酸的研究

目的利用转基因何首乌Polygonum multiflorum毛状根对青蒿酸进行生物转化研究,分离鉴定其转化产物。方法何首乌毛状根预培养7 d,投入青蒿酸,培养2 d,终止反应,利用TLC和GC-MS对转化产物进行检测,利用硅胶柱、ODS反相柱和Sephadex LH-20柱色谱对转化产物进行分离纯化,并根据理化数据和波谱技术鉴定转化产物的化学结构。结果青蒿酸在何首乌毛状根中发生了转化反应,经GC-MS检测可生成多种青蒿素类化合物。分离鉴定了2个转化产物:异青蒿内酯(1)和3β-羟基青蒿酸(2),利用GC-MS鉴定了另外2个转化产物:去氧青蒿素B(3)和青蒿内酯(4)。结论本实验首次利用转基因植物器官对青蒿酸进行生物转化研究,得到3个青蒿素类化合物和1个羟基化产物。该研究一方面填补了转基因植物器官对青蒿素类化合物生物转化的空白,另一方面也丰富了转基因何首乌毛状根的化合物转化类型。     

ATP结合盒转运蛋白与药用植物次级代谢物转运的研究进展

三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白是生物体内分布最为广泛的蛋白家族之一.在调控植物生长发育、根系形态、次级代谢物转运、抗逆胁迫上发挥重要作用.在逆境中产生和累积的次级代谢物往往决定着药用植物的品质.因此,如何提高次级代谢物累积一直作为药用植物品质形成的研究领域热点.研究表明,次...     

Production of Active Compounds in Medicinal Plants: From Plant Tissue Culture to Biosynthesis

Over past decades plant tissue culture has emerged as an alternative of whole plant cultivation in the production of valuable secondary metabolites.Adventitious roots culture of Panax ginseng and Echinacea purpure has reached the scale of 1-10 kL.Some molecular biological techniques,such as transgenic technology and genetic stability are increasingly used in the studies on plant tissue cultures.The studies on elicitors have deepened into the induction mechanism,including signal molecules,functional genes,and so on.More and more biological elicitors,such as A.niger and yeast are used to increase the active compounds in plant tissue cultures.We also discussed the application of synthetic biology in the studies on biosynthesis of artemisinin,paclitaxel,and tanshinon.The studies on active ingredients biosynthesis of medicinal plants provide unprecedented possibilities to achieve mass production of active ingredients.Plant tissue cultures can not only produce active ingredients but also as experimental materials for biosynthesis.In order to improve the contents of active compounds in medicinal plants,following aspects could be carried out gene interference or gene silencing,gene overexpression,combination with chemical synthesis,application of elicitors,and site-directed mutagenesis of the key enzymes.     

药用植物根际微生物对其品质形成的影响及其作用机制的研究进展

根际是植物-土壤-微生物信息和物质交换的重要场所,是影响植物生长和抗逆性的重要因素。植物根系和根际微生物之间的相互作用对于植物的生长和品质形成至关重要。植物根系通过分泌有机酸、糖类、次生代谢物等物质特异性的促进有益微生物的生长,也能通过自身免疫系统和分泌抗生素抑制病原菌的增殖。根际微生物可以通过多种方式参与药用植物的生长发育、代谢过程以及活性成分的积累,对于药用植物的养分吸收和利用、土传病害防治、非生物胁迫应激等方面具有至关重要的作用。主要对根际微生物对药用植物品质形成的影响及其作用机制的研究进展进行综述,以期为深入了解根际微生物与药用植物间的互作关系提供参考。     

植物次生代谢物转运蛋白研究进展

植物在生命活动中产生一系列的次生代谢物,这些化合物在植物细胞内产生后,将转运至特定细胞器进行储存,或被分泌到细胞外。转运蛋白是一类膜蛋白,可介导生物膜内外化学物质的跨膜转运及信号交换,在植物次生代谢物的跨膜运输过程中发挥重要作用。阐明植物次生代谢物转运蛋白的转运功能,有助于解析次生代谢物生物合成及利用途径的分子机制,为开展药用植物活性次生代谢物的合成生物学研究提供重要元件。详细介绍了转运蛋白的结构与分类,综述了近年来植物次生代谢物转运蛋白的研究进展,总结了转运蛋白功能验证的研究方法,为药用植物次生代谢物的生物合成途径解析及开发利用提供参考。     

黄花蒿发根的生长及部分代谢成分的特征研究

目的:研究黄花蒿发根的生长形态和部分次生代谢物特征。方法:比较发根和未转化根的形态差异,测定生长调节剂如萘乙酸(NAA)和赤霉素(GA3)对根生长的影响,分析了发根和未转化根的部分次生代谢物的含量特征。结果:低浓度NAA(0.01～0.05 mg.L-1)能明显促进发根侧根和次侧根的形成,对未转化根则无显著作用,高浓度NAA(0.1 mg.L-1)抑制发根的生长,而对未转化根的生长起促进作用。未转化根中不含有青蒿素,而在发根中检测到较高含量的青蒿素(0.64 mg.g-1),未转化根中青蒿乙素含量较高(1.24 mg.g-1)。在未转化根和发根中,青蒿黄酮chrysoplenetin含量相当,而发根中另一种黄酮化合物artemitin含量(0.76 mg.g-1)是未转化根的3.5倍。结论:黄花蒿发根具有较独特的生长和次生代谢特征。     

水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定

实验采用6种发根农杆菌R1601,R15834,R1000,A4,R1025,R1感染水飞蓟植体,诱导水飞蓟发状根及其水飞蓟宾的产生。6种发根农杆菌均能诱导水飞蓟产生发状根,A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力。实验通过侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发状根产生的条件,确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的增殖。经过PCR分子鉴定,发根农杆菌中的DNA质粒成功的整合到转化根的基因组中。使用液相色谱测定了水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2.5倍。实验所建立的水飞蓟发状根培养系统,为研究水飞蓟发状根大量培养生产水飞蓟宾奠定了基础。     

粘毛黄芩毛状根培养体系的建立及其黄芩苷的动态合成

目的：建立粘毛黄芩毛状根培养体系，并对其生长特性和次生代谢产物的合成进行初步探索。方法：采用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumofaciens C58C1感染粘毛黄芩无菌苗的茎段，获得毛状根，并得到了优质株系；测定了毛状根的生长曲线；利用PCR对毛状根进行T-DNA转化的检测及利用HPLC进行黄芩苷含量检测。结果：PCR检测结果表明，发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合入粘毛黄芩毛状根基因组中。C58C1感染粘毛黄芩无菌苗茎段8 d后，毛状根陆续在其伤口处产生，28 d时幼茎产生毛状根的外植体达81%。1/2 MS液体培养32 d后毛状根干重增加了17.42倍，总黄酮和黄芩苷含量分别增加了21.60，25.56倍。结论：粘毛黄芩毛状根离体培养的建立为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

调控药用植物药效成分合成的转录因子研究进展

大多药用植物的药效成分为植物本身的次生代谢产物,包括生物碱、萜类、类黄酮、酚类、苷类等。植物体内及体外环境条件会影响这些次生代谢产物的合成,导致其合成量的增加或减少,或是影响同类代谢产物不同单体成分的合成与否及合成量。目前所知调控次生代谢产物合成的机制有转录调控、转录后调控等多种形式,其中转录调控研究较多。综述了药用植物类黄酮、生物碱、萜类等活性成分生物合成相关的转录因子研究进展,为利用转录调控控制和提高药用植物药效成分合成的研究与应用提供借鉴。     

丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

目的:建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法:考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率,共培养外植体用400 g.L-1Cef水除菌5 min,接种在MS+400 g.L-1Cef+2.5 g.L-1Hyg的固体培养基上,完全除菌后转接入6,7-V+2.5 g.L-1Hyg液体培养基继代培养,GFP荧光检测阳性毛状根,PCR检测农杆菌特征基因rolC,并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果:用丹参叶片基部诱导毛状根,成功率可达到93.3%;农杆菌侵染10 min诱导效率最高为63.3%;共培养2～3 d诱导效果最好;PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性;丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论:成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系,为进一步的基因工程应用打下基础。     

根特异性过表达β-香树脂醇合成酶基因增加乌拉尔甘草毛状根中甘草酸的含量

Objsective: Glycyrrhizia uralensis, one of the most widely-used traditional Chinese medicines, is mainly cropped in China. However, many cultivars are less in glycyrrhizic acid than Chinese Pharmacopoeia requires. In this paper, we improved glycyrrhizic acid by regulating β-amyrin synthase gene(GuBAS).Methods: Tobacco root-specific promoter TobRB7 and Gu BAS c DNA were obtained and combined with linearized pCAMBIA1305.1 to construct root-specific plant expression vector which was later transformed into Agrobacterium rhizogenes ACCC10060 by electrotransformation. The cotyledons and hypocotyls of G.uralensis were infected by the recombinant A. rhizogenes ACCC10060 to induce hairy roots. The GA content was quantified by HPLC.Results: The PCR and sequencing results both showed that three transgenic hairy root lines were obtained. The copy number of Gu BAS in these transgenic hairy roots was intended by q RT-PCR to be 3, 7,and 4. GA was detected by HPLC, and the results showed that GA was present in the three transgenic hairy roots, while absent in wild hairy roots.Conclusion: Over-expressing Gu BAS root-specifically in hairy roots of G. uralensis enhanced GA accumulation.     

丹参毛状根的诱导及培养条件的优化

为了建立丹参毛状根的诱导方法及液体培养体系,以发根农杆菌A4,LBA9402,15834为试验菌株分别侵染丹参无菌苗叶片,诱导丹参毛状根,PCR扩增筛选阳性株系,HPLC测定丹酚酸含量并在此基础上进一步优化毛状根的液体培养条件。结果显示：3种发根农杆菌A4,LBA9402,15834均诱导出丹参毛状根,经PCR鉴定证明其Ri质粒T-DNA均已整合到丹参基因组中,其中发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数分别为（3.27±0.37）%,（3.17±0.20）%;由发根农杆菌LBA9402诱导MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量较高,质量分数为（4.56±0.36）%;由发根农杆菌LBA9402诱导,pH为4.81的MSOH液体培养基培养的丹参毛状根丹酚酸含量最高可达4.85%。因此,以发根农杆菌LBA9402和A4诱导的丹参毛状根在pH为4.81的MSOH液体培养基中培养的丹酚酸含量较高。为进一步利用基因工程技术改良中药丹参的品质奠定了基础。