抗原致敏树突状细胞诱导CTL杀伤K562细胞体外实验研究

目的 研究体外负载K562细胞冻融抗原的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的特异性杀伤作用。方法 联合应用细胞因子从外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出DC,在体外负载K562细胞冻融抗原。采用乳酸脱氢酶释放法,对比K562冻融抗原致敏DC组、未致敏DC组、淋巴细胞组、前列腺癌PC3冻融抗原致敏DC组分别激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果 培养出具有典型特征的DC;在效靶比为10：1及20：1时。K562冻融抗原致敏DC组诱导的CTL对K562细胞的杀伤率分别为55．9％土22．0％、90．2％＋24．8％,均高于其他3组（p,0．05）。结论 K562细胞冻融抗原致敏DC可诱导激活CTL,具有明显杀伤K562细胞作用。并具有特异性。     

树突状细胞与胃癌细胞融合诱导抗肿瘤免疫反应的体外实验研究

目的:利用杂交瘤技术将脐血来源DCs和SGC7901胃癌细胞融合,以研究融合细胞的生物学特性及其抗肿瘤的功能。方法:利用聚乙二醇(PEG)化学融合技术将DCs和胃癌SGC7901细胞融合,SP免疫组化方法鉴定细胞表型;MTT法测定融合细胞刺激同源异体T淋巴细胞增殖效应;细胞毒性试验检测融合细胞诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对SGC7901的杀伤作用。结果:DCs和SGC7901胃癌细胞在PEG的作用下成功融合,其融合细胞即表达肿瘤标记物CEA,又表达DCs标记物HLA-DR,融合细胞刺激T淋巴细胞增殖能力显著高于DCs、DCs+SGC7901及SGC7901。融合细胞活化的CTL对胃癌细胞杀伤率为21.4%±0.0165%,明显高于DCs组(16.3%±0.0015%)、混合细胞(15.3%±0.0044%)及胃癌组(11.2%±0.0156%)。结论:脐血来源的DCs在PEG作用下能成功与胃癌细胞融合,且融合细胞可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗肿瘤免疫作用。     

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.     

两种抗原致敏方式负载树突状细胞疫苗对LNCaP细胞株的体外杀伤作用

目的：比较验证重组腺相关病毒负载PSA基因转染方式与LNCaP细胞裂解物诱导方式对产生树突状细胞（DCs）疫苗的的影响．方法：抽取HLA表型为A2的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养．通过反复冻融LNCaP细胞、提取肿瘤细胞裂解物以及使用含PSA片段的重组腺相关病毒转染未成熟DCs,诱导特异性细胞毒性T细胞（CTL）．检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测两组CTL对LNCaP细胞的杀伤作用,同时使用腺相关病毒转染组诱导的CTL对LNCaP和DU145两种前列腺癌细胞进行杀伤实验检测．结果：两种方式均可培养成熟的DCs,诱导激活CTL并分泌IFN-γ,而腺相关病毒转染的DCs成熟度和CTL诱导率均高于细胞裂解物组;腺相关病毒转染组诱导的CTL对LNCaP细胞的杀伤率显著高于细胞裂解物组诱导的CTL;腺相关病毒转染组诱导的CTL对LNCaP细胞有特异性杀伤作用．结论：两种抗原递呈方式均可培养出成熟的DCs,并可诱导自体CTL增殖;而使用重组腺相关病毒转染PSA至DCs的方式明显优于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式,具有高效特异性．     

CML自体树突状细胞对CML白血病细胞作用的研究

目的　研究慢性粒细胞白血病 (CML)自体树突状细胞 (DC)对费城 (Ph)染色体细胞的作用。方法　采用液体培养法从 4例 CML 慢性期患者外周血单个核细胞 (PBMNC)中培养出 DC及 T细胞 ,而后将 DC加 IL- 2或 IL- 2激活的 T细胞 ,分别与自体 PBMNC及 K5 6 2细胞共同孵育 6 h,行常规染色体测定 ,分析自体及 K5 6 2 Ph+染色体细胞残存率。结果　从 4例 CML 患者 PBMNC中培养出约 3× 10 5～ 2× 10 6 PBMNC的自体 DC;DC加 IL-2激活的 T细胞比单用 IL- 2激活的 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强 (P<0 .0 0 1) ;DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞的杀伤作用强于对 K5 6 2 Ph+染色体细胞的杀伤作用 (P<0 .0 0 1)。结论　 DC激活的 T细胞能有效抑制 Ph+染色体细胞 ;CML 患者 DC激活的自体 T细胞对自体 Ph+染色体细胞特异性的杀伤作用可能受到主要组织相容性 (MHC)的限制     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

两种抗原致敏方式负载树突状细胞疫苗对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的 比较两种抗原负载方式对树突状细胞(DCs)疫苗的影响.方法 抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养.通过反复冻融LoVo细胞,提取肿瘤细胞裂解物或者使用含CEA片断的重组腺相关病毒转染未成熟DCs,诱导特异性细胞毒性T细胞.检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测两组CTL对LoVo细胞的杀伤作用.结果 两种方式均可培养的成熟DCs,诱导的CTL细胞分泌IFN-γ有所增加;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LoVo细胞,腺相关病毒提呈抗原制备的DCs疫苗对LoVo细胞的杀伤作用明显高于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.结论 两种抗原提呈方式均可培养出成熟的DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,并可诱导自体CTL增殖.使用腺相关病毒转染DCs的方式明显优于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式.     

gp96多肽复合物介导的细胞毒性T淋巴细胞对食管腺癌细胞的免疫杀伤作用

目的:研究肿瘤细胞来源的gp96多肽复合物介导的对同一类型肿瘤的免疫治疗作用.方法:提取纯化食管腺癌细胞系SEG-1裸鼠成瘤组织的gp96蛋白多肽复合物,与外周血单个核细胞(PBMNC)诱导培养的树突状细胞(DC)结合,制备gp96-DC疫苗;台盼蓝拒染法测定淋巴细胞增殖率;ELISA方法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)培养上清液的γ干扰素(IFN-γ)含量,MTT法检测CTL对靶细胞SEG-1的杀伤率.结果:55 g瘤组织提取纯化gp96蛋白120μg;单独DC、单独gp96及gp96-DC均能刺激淋巴细胞增殖,产生CTL,释放IFN-γ,对靶细胞SEG-1均显示一定的杀伤作用,以gp96-DC的作用最明显,在效靶比40:1时,杀伤率为68%.单独DC诱导的CTL对SEG-1、K562的杀伤作用与非抗原刺激的淋巴细胞比较,统计学差异无显著性.结论:肿瘤来源的热休克蛋白gp96可使DC具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力,所产生的CTL对靶肿瘤细胞有明显的特异杀伤作用.     

负载食管癌抗原肽树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效应

目的:研究负载食管癌抗原肽树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人食管癌细胞株 TE 1的杀伤效应。方法:用弱酸洗涤TE 1细胞获得抗原肽,将此负载到树突状细胞并与淋巴细胞混合培养,制备 CTL,用Cr51释放法测定其对TE 1细胞的杀伤活性。结果:负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对TE 1细胞的杀伤 率为(78.62±3.51)%,未负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对TE 1的杀伤率为(10.52±5.51)%,二者差异有统 计学意义(P<0.05);负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对酸洗前TE 1杀伤率为(60.63±7.24)%,对酸洗后 TE 1的杀伤率为(8.64±4.12)%,两者差异有统计学意义(P<0.05);负载食管癌抗原肽DC诱导的CTL对 Eca 109的杀伤率为(56.21±8.76)%,而对K59和786 0的杀伤率分别为(15.89±11.80)%和(3.95±2.99)%。 结论:酸洗可以从TE 1细胞上获得有效的抗原肽;负载食管癌抗原肽的DC可以诱导生成高效特异的CTL。     

肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

目的将肝细胞癌(HCC)患者树突状细胞(DCs)与肝癌细胞HepG2融合制备瘤苗,检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应.方法以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞(PBMCs),应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhlL-4)体外诱导培养DCs;聚乙二醇融合DCs与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(DCs/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒性实验检测DCs/HepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果融合细胞DCs/HepG2高表达成熟DC表面分子,其中CD8390.4%,CD8087.7%,CD8684.4%,HLA-DR98.5%;其刺激同源T淋巴细胞增殖的能力显著高于HepG2和DCs;DCs/HepG2活化的CTL对HepG2具有显著杀伤作用,其杀伤率为(63.5±4.6)%(效靶比例为20∶1).结论HCC患者外周血DC融合HepG2细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫效应,可能成为HCC免疫治疗的有效途径.     

胆管癌肿瘤裂解物修饰和P53基因导入对树突状细胞免疫效应的影响

目的 :研究胆管癌裂解物对转染全长野生型P5 3的树突状细胞 (DC)免疫功能的影响。方法 :用腺病毒作为介质 ,将全长野生型P5 3转染入DC ,然后用胆管癌裂解物修饰已转染全长野生型P5 3的DC(LywtP5 3DC) ,检测这种DC表面分子B7 1、B7 2、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ表达的高低 ,诱导特异的细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs)的能力 ,对小鼠的免疫保护和对动物模型治疗作用。结果 :经流式细胞仪检测胆管癌裂解物刺激的野生型P5 3DC表面高表达B7 1(86 .70 %± 0 .0 7% )、B7 2 (18.77%± 0 .0 8% )、MHC Ⅰ (87.2 0 %± 0 .0 5 % )、MHC Ⅱ (5 6 .70 %± 0 .0 7% ) ,单纯DC低表达 ;LywtP5 3DC能够特异性地杀伤胆管癌细胞 ,杀伤率为 81%。LywtP5 3DC治疗组和其它组在肿瘤生长的直径大小之间有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,在LywtP5 3DC治疗组中 ,肿瘤生长明显减慢。结论 :全长野生型P5 3基因转染 +胆管癌裂解物联合修饰的DC能诱导细胞毒性T淋巴细胞的特异性 ,显著地提高DC的抗原提呈功能 ,体外能诱导高效而特异的抗胆管癌免疫效应。     

Effects of Dendritic Cells Transfected with Full Length Wild Type P53 and Modified by Gastric Cancer Lysate on Immune Response

Dendriticcells (DCs)arethemostpotentanti gen presentingcellsandareactivelyusedincancerimmunotherapy .Thewild typep5 3,asanantigen ,caninducespecificcytotoxicTlymphocytes (CTLs)inthehostbody .Itisaneffectivemethodtoimmu nizebodywith p5 3in p5 3 overexpress…     

中药功劳木提取物对肿瘤MDR的逆转作用

目的:研究中药功劳木的4种不同工艺提取物逆转肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的作用,以开发新型的肿瘤MDR逆转剂。方法:采用MTT法检测4种提取物的细胞毒性及其对阿霉素(adriamycin,ADM)的增敏效果;罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)蓄积实验检测4种提取物对细胞内药物浓度及P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能的影响;流式细胞仪检测4种提取物对耐药肿瘤细胞凋亡的影响。结果:10 mg/L为4种提取物的无毒剂量;在此剂量下,4种提取物对K562/ADM细胞逆转倍数分别为Ⅰ-4.81倍,Ⅱ-2.31倍,Ⅲ-4.17倍,Ⅳ-2.39倍,对MCF-7/ADM细胞的逆转倍数分别为Ⅰ-1.82倍,Ⅱ-1.40倍,Ⅲ-2.54倍,Ⅳ-1.51倍;此剂量的4种提取物应用后,使K562/ADM细胞凋亡率分别增加了Ⅰ-13.27%、Ⅱ-7.03%、Ⅲ-20.24%、Ⅳ-11.75%,使MCF-7/ADM细胞凋亡率分别增加了Ⅰ-6.3%、Ⅱ-3.67%、Ⅲ-8.6%、Ⅳ-3.48%。结论:中药功劳木的4种不同工艺提取物能够不同程度的逆转肿瘤细胞的MDR,抑制肿瘤细胞膜上P-gp的“药泵”功能,增加耐药细胞内药物浓度,有望成为肿瘤多药耐药逆转剂的候选药物。     

布-加综合征患者血浆抗凝蛋白测定

目的:探讨布加综合征(Buddchiarisyrdrome,BCS)患者血浆抗凝蛋白[抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ),蛋白C(PC],蛋白S(PS))水平及其意义。方法:测定30例布加综合征患者外周血浆中ATⅢ,PC,PS及Ⅶ因子水平,并和30例正常人,30例乙肝后肝硬化患者做对照。结果:布加综合征患者和乙肝后肝硬化患者ATⅢ,PC,PS水平低于正常对照组[ATⅢ(82.9%±13%),(72.4%±16%),(103.5%±23%),PC(86.5%±19.5%),(73.5%±17.2%),(102.5%±20.1%),PS(84.6%±28.5%),(78.3%±26.3%)(100.9%±29.1%),P均<0.05],但在Ⅶ因子水平对ATⅢ,PC,PS水平的影响,在布加综合征组和乙肝后肝硬化对照组无差别[bATⅢ(0.92,0.93),bPC(0.96,0.94),bPS(0.86,0.88),P<0.05]。结论:布加综合征患者抗凝蛋白水平低于正常人水平,但其原因与继发肝功能损害有关。     

rhHSP70对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导CTL抗肿瘤功能的影响

目的研究重组人热休克蛋白70(rhHSP70)联合食管癌细胞RNA转染脐血树突状细胞(DCs)对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性抗肿瘤作用的影响。方法分离脐血单个核细胞,经rhSCF、rhGM-CSF和IL-4诱导和食管癌RNA转染形成成熟DCs,加入rhHSP70,检测DCs表面标志及DCs诱导的T细胞增殖、CTL杀伤活性。结果食管癌RNA转染后DCs高表达抗原提呈分子、协同刺激分子和黏附分子,对T细胞的促增殖作用和CTL杀伤活性显著增强(P<0.01),rhHSP70能显著促进DCs功能。结论 rhHSP70具有增强食管癌细胞RNA转染的DCs对T细胞的促增殖和CTL杀伤活性的作用。     

左卡尼汀应用于新生儿血清CK-MB异常的治疗及效果评价

摘要： 目的 探讨左卡尼汀对新生儿血清CK-MB水平的影响及其临床意义。 方法 因各种原因引起血清CK-MB异常的新生儿80例和血清CK-MB水平正常的新生儿20例,前者（实验组）随机分为4组各20例并分别予以不同干预方案：静脉小剂量左卡尼汀治疗组（小剂量组）予左卡尼汀注射液每日0.1g/kg静脉滴注;静脉大剂量左卡尼汀治疗组（大剂量组）予左卡尼汀注射液每日0.15g/kg静脉滴注;左卡尼汀及果糖治疗组（复合药物组）予左卡尼汀注射液每日0.1g/kg静脉滴注及果糖每日0.16g/kg静脉注射;果糖治疗组予果糖每日0.16g/kg静脉注射。后者（对照组）予以一般支持对症治疗。治疗以7d为1个疗程,所有新生儿自出生后即进入观察阶段。观察生后第1d用药前、第3d及第7d血清CK-MB的变化。 结果 ①各组1w内的血清CK-MB稳定下降率分别为小剂量组75%、大剂量组85%、果糖组45%、复合药物组85%、对照组85%（χ2=5.71,P＜0.05）;各实验组治愈率分别为小剂量组95%、大剂量组95%、果糖组75%、复合药物组95%（χ2=1.27,P＞0.05）。②生后第3d,各组血清CK-MB水平较第1d均有下降,下降程度分别为小剂量组59±23%、大剂量组55±26%、果糖组67±19%、复合药物组58±29%、对照组18±12%（P＜0.05）。③生后第7d,各组均有部分新生儿的血清CK-MB数值较第3d上升,各组上升例数占本组总例数的百分比分别为小剂量组25%、大剂量组 15%、果糖组55%、复合药物组15%、对照组15%（P＜0.05）。④生后第7d,各组血清CK-MB较第3d下降的百分比均值分别为小剂量组48±21%、大剂量组36±18%、果糖组22±18%、复合药物组28±21%、对照组23±18%（P＜0.05）。⑤生后第7d,各组患儿血清CK-MB水平分别为小剂量组34.25±14.2U/L,大剂量组34.95±18.6U/L,果糖组57.21±40.1U/L,复合药物组37.05±13.7U/L,对照组33.7±10.9U/L（P＜0.05）。 结论 应用左卡尼汀能有效地降低新生儿异常的血清CK-MB水平,且作用较应用果糖明显。     

Effects of partial portal vein arterialization on liver regeneration after hepatectomy in minipigs with obstructive jaundice

Background  Hilar cholangiocarcinoma is a malignant tumor that is difficult to cure. BACKGROUNDThe aim of this study was to observe the effects of flow-controlled partial portal vein arterializations (PPVA) on liver regeneration after hepatectomy in minipigs with chronic obstructive jaundice.

Methods  Eight minipigs were made into chronic obstructive jaundice models. United semi-hepatectomy, which imitates extended radical surgery for treatment of hilar cholangiocarcinoma, was then performed. The eight minipigs were randomly divided into groups A and B (n=4 minipigs each). PPVA was performed in Group A but not in Group B. The effects of flow-controlled PPVA on live regeneration after hepatectomy were observed for 30 days after hepatectomy.

Results  The portal vein PO₂ at the immediate time point and on postoperative day 30 was higher in Group A ((47.33±2.43) and (48.50±4.44) mmHg) than in Group B ((35.38±4.06) and (35.55±2.55) mmHg respectively, all P <0.01). The mitotic index of liver cells on postoperative days 14 and 21 was higher in Group A (12.55%±2.85% and 15.25%±1.99% respectively) than in Group B (6.85%±2.10% and 11.88%±1.15% respectively, all P <0.05). The regeneration rate of residual liver on postoperative days 14 and 21 was higher in Group A (24.56%±6.15% and 70.63%±9.83% respectively) than in Group B (11.96%±5.43% and 44.92%±7.42% respectively, P <0.05 and P <0.01 respectively).

Conclusion  Flow-controlled PPVA can promote liver regeneration after hepatectomy and prevent liver failure in minipigs with chronic obstructive jaundice.