金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响

目的 利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响.方法 分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株.并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究.结果 突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atlA基因编码的双功能自溶素前体蛋白(AtlA蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atlA基因的转录水平较野生株显著降低.结论 psmα缺失后能够降低atlA基因的转录表达水平.     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

双向选择标记amdS在黑曲霉中自发突变及amdS-检测

目的将传统上作为营养缺陷标记的amdS进行诱变,使其成为双向选择标记,有利于构建黑曲霉多基因缺失菌株。方法以已有amdS作选择标记的黑曲霉双基因缺失株为出发突变株,在以尿素为唯一氮源的氟代乙酰氨培养基上筛选amdS-突变菌株。结果将另一以amdS作选择标记的基因进行转化,得到一株三基因缺失菌株。结论在黑曲霉中利用amdS可作为双向选择标记的特点,构建多基因缺失菌株是行之有效的。     

大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株运动能力研究

目的 通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株,探讨qseC基因对大肠杆菌运动能力的影响.方法 PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化入大肠杆菌MC1000,在Red同源重组酶作用下,用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的 基因qseC,并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.测定qseC基因缺失株运动能力的变化.结果 qseC基因已被成功敲除.在LB培养基中,qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异.MC1000与MC1000qseC基因缺失株运动圆环的直径分别为(6.10±0.36)mm和(3.20±0.53)mm(P<0.01).结论 成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株,且qseC基因对细菌运动能力具有重要调控作用.     

肺炎克雷伯菌KbvR调控因子对细菌生物膜与荚膜形成能力的影响

目的构建肺炎克雷伯菌LuxR家族KbvR基因缺失突变株与回补株,分析KbvR在肺炎克雷伯菌生长、生物膜形成及荚膜 生成中的作用。方法通过自杀载体pKO3-Km质粒构建KbvR基因敲除株,然后扩增出包含KbvR基因编码区、启动子结合区及 转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-T-easy质粒上构建KbvR基因回补株。绘制不同菌株生长曲线,了解KbvR对细菌生长的 影响。通过结晶紫定量实验检测KbvR基因对细菌生物膜形成的影响,拉丝实验、离心试验及RT-PCR检测KbvR基因对细菌荚 膜形成的影响。结果成功获得KbvR基因缺失突变株及回补株,RT-PCR结果显示KbvR基因在缺失突变株中不表达,在回补株 中重新表达。KbvR基因不影响细菌的生长速度,基因敲除株后细菌生物膜形成及荚膜生成能力下降。体外试管静止培养48 h, 与野生株相比基因缺失突变株生物膜形成能力明显下降,而KbvR基因回补株在液体培养基表面能形成明显生物膜。结晶紫染 色定量实验发现,基因缺失突变株生物膜形成能力显著低于野生株（P<0.01）。超粘性实验和RT-PCR结果均显示,KbvR基因缺 失突变株荚膜形成能力明显下降,说明KbvR基因影响肺炎克雷伯菌生物膜和荚膜的形成。结论KbvR基因作为密度感应系统 LuxR孤儿调控转录因子,正调控肺炎克雷伯菌生物膜的形成。荚膜是细菌生物膜形成的重要因素,KbvR基因可通过影响荚膜 形成而调控生物膜的形成。     

酵母PHO8与PHO13双基因缺失酵母菌株构建

目的 构建碱性磷酸酶PHO8与PHO13双基因缺失酵母菌株。方法 依据基因同源重组原理,采用一步基因置换法构建编码Pho8蛋白N端60个氨基酸残基（包括跨膜结构域）缺失的PHO8基因缺失酵母（pho8?60）菌株;线性化载体p RS303-pho13-ko转化pho8?60菌株,进一步缺失PHO13基因,构建pho8?60和PHO13双基因缺失（pho8?60pho13?）菌株;通过缺陷型培养基筛选方法,PCR鉴定阳性克隆基因组DNA。结果 pho8?60菌株电泳条带为1 151 bp和180 bp,pho8?60pho13?菌株电泳条带分别为1 872 bp和174 bp。结论 成功构建pho8?60pho13?酵母菌株。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 z0986-z1444双缺失突变株构建

目的 采用Red重组方法敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 z0986和z1444基因,构建双缺失突变株.方法 首先构建z0986、z1444打靶片段;其次以电击法转化感受态细胞,之后通过PCR鉴定所得菌株;最终所得阳性单克隆测定生长曲线.结果 z1444单基因缺失突变株(Δz1444/933)及z0986-z1444双基因缺失突变株(Δz0986/Δz1444/933)构建成功,其生长曲线与野生型EHEC O157:H7差异均无统计学意义.结论 z0986与z1444基因缺失对EHEC的生长无影响.构建Δz1444/933及Δz0986/Δz1444/933为深入研究z1444基因的功能及作用机制奠定了基础.     

PhoB缺失突变株的构建及其性状的初步研究

目的为探索B族链球菌（group B streptococcus，GBS）的毒力全局性调控机制，对GBS中的双组分信号传导调控系统PhoR—PhoB的成分之一PhoB的功能进行了初步研究。方法首先应用计算机软件对GBS基因组进行分析，寻找PhoB同源基因，接着通过同源交换法在GBSⅠa515和V2603菌株中构建PhoB缺失突变株，并通过Southem杂交分析对其基因型进行了确证，通过RT—PCR法、菌落印迹分析、生长曲线测定等方法对其表型特性进行了初步研究。结果在GBS中发现了PhoB同源基因并成功地在GBSⅠa515和V2603菌株中构建了PhoB缺失突变株ΔPhoB，对其基因型、表型特性及功能的初步研究结果表明此突变株为非极性缺失突变株，其缺失突变不影响其下游基因的表达；此缺失突变不影响GBS在THY及CDM培养基中生长速度的改变。结论在GBS中构建并确证了非极性PhoB基因缺失突变株，为GBS中毒力全局性调控机制的进一步研究提供了有利的工具。     

frtR基因对变异链球菌产酸及脱矿能力影响的研究

目的 研究TetR家族frtR基因对变异链球菌产酸能力和诱导牙体脱矿能力的影响.方法 检测frtR基因框内缺失株(ΔfrtR)及回复株(ΔfrtR/pDL278-frtR)的生长情况;通过共聚焦激光扫描显微镜观察菌株的生物膜结构,并用蒽酮-硫酸法定量检测生物膜中的水不溶性胞外多糖(extracellular polys...     

变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组学分析

  目的  对变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。  方法  培养变异链球菌UA159、csn2基因的缺失菌株Δcsn2及回补菌株。提取总RNA,采用高通量测序技术,进行转录组测序,基于差异表达基因GO和KEGG数据库分析的基础上,对其参与的生物学过程进行挖掘,采用qRT-PCR的方法验证转录组测序结果。  结果  转录组结果显示与UA159相比,Δcsn2中基因表达量变化在1倍以上的基因有176个（P<0.05）,其中上调表达基因72个,下调表达基因104个,通过GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析,发现上调和下调的差异表达基因（DEG）均参与的功能为氨基酸转运和代谢。除此之外,上调的DEG参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、能量产生和转化、转录等有关;下调的DEG主要与脂质代谢、DNA的复制、重组和修复、信号转导机制、核苷酸转运和代谢等生物过程有关,还有部分DEG的功能尚不清楚。qRT-PCR验证发现,与UA159及Δcsn2/pDL278-csn2 菌株相比,与支链氨基酸形成相关的基因leuA、leuC和leuD在Δcsn2中的表达显著下调。  结论  通过转录组测序和qRT-PCR验证发现Δcsn2中与支链氨基酸合成与细胞膜通透性相关的基因表达量发生了明显变化。     

SMU.2055基因对变异链球菌UA159耐酸能力的影响

目的针对变异链球菌（S. mutans）UA159构建SMU.2055基因缺陷菌株,研究SMU.2055基因对S. mutans耐酸能力的影 响。方法利用同源重组的方法,构建SMU.2055基因缺陷菌株。连续监测野生菌株和基因缺陷菌株在不同pH值环境中菌液的 A600值,比较在不同pH值条件下的生长能力。将两种菌株转入一组pH值跨度为2.5~7.0的BHI培养基,厌氧培养3 h,观察其致 死性pH值。加入过量的葡萄糖,检测两种菌株糖酵解能力。制备通透细胞,分别检测两种菌株的细胞通透性、质子通透性和 H+-ATPase活性。激光共聚焦显微镜下观察两种菌株生物膜形成能力。结果与野生菌株相比,SMU.2055基因缺陷菌株早期生 长活性、pH5.5时H+-ATPase活性、生物膜形成能力均明显下降,致死性pH值、质子通透性、细胞通透性均明显升高,糖酵解能力 未见明显变化。结论SMU.2055基因与S. mutans的耐酸性作用相关。SMU.2055基因缺陷菌株耐酸能力的降低与其致死性pH 值、细胞通透性、质子通透性、H+-ATPase活性、生物膜的形成有关,与其糖酵解能力无关。对研究SMU.2055基因功能奠定基础。     

双响应性透明质酸碳量子点-明胶纳米递药系统的构建及抗肿瘤效果评价

  目的  通过构建pH和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）双响应性粒径可变纳米递药系统,协同提高化疗药物在肿瘤组织的高效滞留和高效穿透,增强肿瘤治疗效果。  方法  构建了透明质酸（hyaluronic acid, HA）碳量子点（carbon quantum dots, CD）偶联明胶纳米粒（gelatin nanoparticle, GNP）,通过pH敏感的亚胺连接化疗药物阿霉素（doxorubicin, DOX）,得到GNP@HA-CD-DOX纳米粒并进行表征,考察粒径变化能力、释药行为、血液相容性、细胞摄取和肿瘤球深层穿透能力、体内肿瘤分布以及治疗效果。  结果  GNP@HA-CD-DOX纳米粒粒径为（162.93±2.55） nm,在MMP处理下可降解释放出粒径约40 nm的HA-CD-DOX。该纳米粒DOX载药量为（4.94±0.22）%,DOX可以在肿瘤微环境和溶酶体中响应低pH释放。GNP@HA-CD-DOX无明显溶血现象;与MMP-2共孵育后粒径减小,能够明显提高细胞摄取和肿瘤球中的深层穿透。GNP@HA-CD-DOX在荷瘤小鼠模型上表现出优于小粒径HA-CD-DOX的肿瘤分布和抗肿瘤能力,且安全性较好。  结论  该pH和MMP酶双响应粒径可变的纳米递药系统协同提高药物在肿瘤的滞留和深层穿透,提高了抗肿瘤效果,为肿瘤治疗提供了新的思路。     

丹参酮ⅡA-甘草酸自组装纳米胶束的制备及体外抗脑胶质瘤评价

  目的  将丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA, Tan ⅡA)封装于甘草酸(Glycyrrhizic acid, GL)中自组装得到胶束, 考察其制备工艺并对产物进行表征, 同时进行体外抗胶质瘤细胞活性评价。  方法  采用薄膜分散法制备载丹参酮ⅡA-甘草酸自组装胶束(Tan ⅡA-GL/Micelle, TGM)。测定TGM的粒径、多分散系数以及Zeta电位；透射电子显微镜观察TGM的形态特征；高效液相色谱法测定TGM的包封率；透析袋法考察TGM的药物释放情况。倒置荧光显微镜考察TGM体外跨血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)的能力; 定量考察细胞摄取的具体机制; MTT法考察游离Tan ⅡA、游离GL和TGM分别对鼠源性脑胶质瘤细胞GL261的细胞毒性; 流式细胞仪检测游离Tan ⅡA、游离GL及TGM对GL261的细胞凋亡作用。  结果  薄膜分散法是制备载丹参酮ⅡA-甘草酸自组装胶束的最佳工艺方法; TGM粒径约为(121.87±5.85)nm, Tan ⅡA包封率为(88.54±14.27)%, 呈类球形形态, 制剂均一稳定; 可在5 h左右释放包载药物。TGM具有良好的跨BBB能力; 脑胶质瘤细胞摄取自组装胶束的机制为通过网格蛋白介导的胞吞来进行制剂的摄取; 对于脑胶质瘤细胞GL261具有良好的细胞毒性; 细胞凋亡实验结果表明, TGM相较于Free TanⅡA、Free GL组显著提高细胞凋亡水平, 促细胞凋亡率分别由12.28%、13.32%上升至31.16%。  结论  GL与Tan IIA通过自组装形成了纳米胶束，有效克服TanⅡA生物利用度低、水溶性差等缺点。TGM可有效跨越BBB，通过网格蛋白介导的胞吞途径被脑胶质瘤细胞摄取，具有良好的细胞毒性与促细胞凋亡能力。      

T1b期肾癌行保留肾单位手术最佳切缘的探讨

  目的  分析T_1b期肾癌病理学特点,同时探讨该期肾癌行保留肾单位手术的最佳手术切缘。  方法  回顾性分析2013年9月?2017年12月于我院行手术治疗的245例T_1b期肾癌患者的临床及病理资料。  结果  245例患者中男158例,女87例,平均年龄59.6岁,平均肿瘤大小5.3 cm。行根治性肾切除术者174例,保留肾单位手术者71例。术后病理学检查为肾透明细胞癌209例（85.3%）,219例（89.4%）患者瘤体周围可见明显假包膜,其中26例（10.6%）患者肿瘤细胞穿透假包膜并侵入周围肾实质,浸润深度在1 mm、1～2 mm和2～3 mm的肿瘤分别为7例（26.9%）、16例（61.5%）和3例（11.5%）。24例（9.8%）患者可见多发性肿瘤。肾部分切除术的平均切缘为5 mm（3～7 mm）。  结论  保留肾单位手术可用于T_1b期肾癌,为避免切缘阳性,切缘距肿瘤表面应至少3 mm。     

基于黑猩猩腺病毒6型的新型溶瘤病毒抑瘤研究

目的 以6型黑猩猩腺病毒(AdC6)为载体,构建一组新型溶瘤腺病毒,使之获得瘤内特异性复制能力.在体内外检测其抑瘤效果,并探讨其溶瘤机制.方法 以AdC6载体为基础,以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动该腺病毒的复制相关基因E1A表达,获得重组溶瘤病毒AdC6-htertE1A-ΔE3,同源构建表达粒细胞-巨噬细...     

阿托伐他汀钙影响大鼠背部超长随意皮瓣成活的研究

  目的  探讨不同剂量阿托伐他汀钙（atorvastatin calcium, ATR）对大鼠背部超长随意皮瓣成活的影响。  方法  将30只SD大鼠随机分为5组,每组6只:0.9%生理盐水对照组（CON组）、ATR（10 mg/kg）组（P10组）、ATR（20 mg/kg）组（P20组）、ATR（30 mg/kg）组（P30组）、ATR（40 mg/kg）组（P40组）。各组的每只大鼠背部制作8 cm×2 cm的随意皮瓣并原位回植。在术前3 d和术后3 d连续6 d按分组灌胃对应剂量的ATR或0.9%生理盐水,每天1次。术后第7 天,肉眼观察大体皮瓣外观,计算皮瓣的成活率并切取皮瓣存活区域组织（距坏死区0.5 cm的存活皮瓣）,分别行HE染色观察皮瓣组织学变化,免疫组织化学法检测皮瓣微血管数量,实时荧光定量PCR检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）mRNA的表达,酶联免疫吸附法测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、一氧化氮（nitrogen monoxide, NO）、丙二醛（malonaldehyde, MDA）的含量。  结果  术后第7天,大鼠大体可见CON组皮瓣出现大面积坏死,坏死部分形成痂壳,痂壳质硬,无弹性,并见大量组织液渗出,筋膜层组织呈暗紫色;P10、P20、P30、P40组皮瓣未见组织液渗出,痂壳自然脱落,皮毛正常生长。HE染色结果显示CON组皮瓣组织中出现大量炎症细胞浸润,伴有表皮缺失、坏死等病理性改变,但ATR治疗后皮瓣组织的病理性改变得到明显改善。与CON组比较,随著ATR剂量提高,皮瓣存活率,皮瓣微血管数量,皮瓣中VEGF mRNA、bFGF mRNA、SOD和NO水平也相应提高,在ATR 30 mg/kg达峰（P<0.05）,但皮瓣中MDA水平却随ATR剂量提高而降低,在ATR 30 mg/kg最低（P<0.05）。  结论  30 mg/kg的ATR对提高大鼠背部超长随意皮瓣的成活率效果最佳,这与ATR促进微血管生成、抗炎及抑制氧化应激相关。     

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

  目的  利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。  方法  针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab（ORF1ab）基因序列保守区设计引物，获得了 RT-LAMP 检测体系，并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。  结果  经检测新型冠状病毒核酸标准物质，其结果与预期相符，证实了该检测体系的可行性。  结论  利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高，适用于边境条件有限地区。     

一个血小板减少伴桡骨缺失综合征家系的遗传学研究及产前诊断

  目的  对一个血小板减少伴桡骨缺失（TAR）综合征家系进行遗传学病因分析及产前诊断。  方法  采用染色体微阵列分析（CMA）、荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Sanger测序对一个TAR综合征家系进行基因突变分析。提取先证者、父母及姐姐4名家系成员的基因组DNA,行CMA、qPCR和Sanger测序,明确致病突变后对胎儿行产前诊断。  结果  先证者1q21.1存在378 kb杂合缺失,内含RBM8A等基因,RBM8A基因还存在c.-21G>A突变,上述突变分别遗传自父母。产前羊水CMA显示胎儿1q21.1存在378 kb微缺失,基因检测未见RBM8A基因c.-21G>A突变。  结论   RBM8A基因1q21.1杂合性缺失和c.-21G>A是本例TAR综合征家系的遗传学病因,为本家系的遗传咨询及产前诊断提供了依据。