mTOR-4EBP1/p70S6K1信号通路在良、恶性胸腔积液中的表达研究

目的 探讨雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-真核启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)/核糖体蛋白S6激酶1(p70S6K1)信号通路在良、恶性胸腔积液中的表达情况,为恶性胸腔积液的发生机制及诊疗靶标研究提供新思路、新方法。方法 选取恶性胸腔积液作为恶性测定组(44例),良性胸腔积液作为良性对照组(44例),实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测mTOR、4EBP1及p70S6K1mRNA表达情况,Western blot检测mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、4EBP1、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、p70S6K1及磷酸化p70S6K1(p-p70S6K1)蛋白表达情况。结果 RT-qPCR结果显示,恶性测定组中mTOR、4EBP1及p70S6K1 mRNA表达水平明显高于良性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果显示,恶性测定组中p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表达水平明显高于良性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组mTOR、4EBP1、p70S6K1蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0....     

1,25-二羟维生素D_3对人结肠癌细胞凋亡和自噬的影响及机制研究

目的观察1, 25-二羟维生素D_3[1, 25-(OH)_2D_3]对人结肠癌HCT-116细胞凋亡和自噬的影响并初步探讨其机制。方法体外培养人结肠癌细胞HCT-116,分成对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和联合组[1, 25-(OH)_2D_3高剂量联合腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂]共5组,观察并比较各组细胞凋亡和自噬情况。结果低剂量组、中剂量组、高剂量组的HCT-116细胞凋亡程度、自噬程度及cleaved Caspase3、cleaved Caspase8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK蛋白表达水平高于对照组, p-mTOR蛋白表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。联合组的HCT-116细胞凋亡程度、自噬程度及cleaved Caspase3、cleaved Caspase8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK蛋白表达水平低于高剂量组, p-mTOR蛋白表达水平高于高剂量组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 1, 25-(OH)_2D_3可通过调控AMPK/mTOR信号通路增强结肠癌细胞凋亡和自噬,发挥抗肿瘤作用。     

归芪益元膏通过AMPK/mTOR自噬信号通路对辐射旁效应损伤大鼠的保护作用及其机制

目的 探讨归芪益元膏通过单磷酸腺苷激活的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)自噬信号通路对辐射旁效应损伤大鼠的保护作用及其机制。方法 将32只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、单纯辐射组及归芪益元膏中、高剂量组,每组8只。归芪益元膏中、高剂量组预先灌胃归芪益元膏[3.28 g/(kg·d)、6.56 g/(kg·d)],其余各组予等量0.9%氯化钠溶液灌胃,连续干预14 d。干预14 d后,单纯辐射组及归芪益元膏中、高剂量组大鼠右肺予8 Gy剂量X射线单次照射,铅皮屏蔽其余身体部位;正常对照组不给予照射。照射后处死所有大鼠,免疫组化、qPCR检测大鼠右肺、左肾组织中的p62、Beclin1、AMPK、mTOR蛋白及mRNA表达情况。结果 单纯辐射组右肺、左肾组织中的p62蛋白及mRNA表达量明显低于正常对照组,Beclin1、AMPK、mTOR蛋白及mRNA表达量明显高于正常对照组(P<0.01)。归芪益元膏中、高剂量组右肺、左肾组织中的p62蛋白及mRNA表达量明显高于单纯辐射组,Beclin1、AMPK、mTOR蛋白及mRNA表达量明显低于单纯辐射组(P&...     

耐力运动对老年小鼠心肌T-钙粘蛋白的影响及其效应研究

目的 观察耐力运动对老年小鼠心肌组织T-钙粘蛋白及其配体脂联素和下游相关分子表达的影响,探讨T-钙粘蛋白的作用。 方法 选取30只17月龄C57雄性小鼠,采用随机数字表法将其分为老年对照组及老年运动组,每组15只;另取15只2月龄C57雄性小鼠纳入为青年对照组。老年运动组小鼠进行12周耐力运动,老年对照组及青年对照组小鼠均正常饲养、无特殊干预。于老年运动组小鼠最后一次运动结束24 h后处死3组小鼠。采用免疫印迹法检测各组小鼠心肌组织T-钙粘蛋白及其配体脂联素表达、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK）磷酸化水平、凋亡及自噬相关信号蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、Beclin-1等表达;采用免疫组化法观察各组小鼠心肌T-钙粘蛋白、脂联素及p-mTOR细胞定位和阳性表达。 结果 T-钙粘蛋白定位于心肌细胞胞膜及血管内皮处,脂联素定位于心肌细胞胞膜、胞浆及血管内皮处,p-mTOR定位于心肌细胞胞浆处。与青年对照组比较,老年对照组心肌T-钙粘蛋白、脂联素、AMPK活化水平、抑凋亡蛋白bcl-2、促自噬蛋白Beclin-1表达显著下调（P<0.05）,促凋亡蛋白bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)表达及自噬相关蛋白mTOR活化水平均显著上调（P<0.05）;与老年对照组比较,老年运动组心肌组织T-钙粘蛋白及配体脂联素、AMPK活化水平、bcl-2、Beclin-1蛋白表达均显著上调（P<0.05),bax、Caspase-9蛋白表达、mTOR磷酸化水平均显著下调（P<0.05）。 结论 耐力运动可增强老年小鼠心肌T-钙粘蛋白表达,促进脂联素与心肌组织结合,刺激AMPK活化,从而发挥对老龄心肌组织的保护作用。     

mTOR、LC3蛋白表达与Ⅰ期非小细胞肺癌相关性的研究

目的检测mTOR和LC3在Ⅰ期非小细胞肺癌组织中的表达量,探究二者与患者长期生存率的关系。方法将组织标本分为Ⅰ期非小细胞肺癌组和癌旁组织对照组,分别应用免疫组化法检测检测mTOR和LC3在两组组织中的表达量,分析比较5年存活率与mTOR和LC3蛋白表达量的关系。结果肺癌组中mTOR蛋白表达量显著高于癌旁组织对照组,差异具有统计学意义(=23.94,P0.05)。肺癌组中LC3蛋白表达量明显低于癌旁组织对照组,差异具有统计学意义(=17.76,P0.05)。Ⅰ期非小细胞肺癌患者中mTOR蛋白阳性者5年存活率为45.16%(14/31),mTOR蛋白阴性者5年存活率为92.86%(13/14),mTOR蛋白阴性者5年存活率高于阳性者,二者差异有统计学意义(P0.05)。Ⅰ期非小细胞肺癌患者中LC3蛋白阳性者5年存活率为66.67%(26/39),LC3蛋白阴性者5年存活率为16.67%(1/6),LC33蛋白阳性者五年存活率高于阴性者,但二者差异没有统计学意义(P0.05)。结论 mTOR在Ⅰ期非小细胞肺癌中表达上调LC3表达下调,而LC3蛋白阳性者mTOR蛋白可能是Ⅰ期非小细胞肺癌预后的危险因素,而LC3蛋白可能是保护因素     

丙泊酚调控PI3K/AKT信号通路对肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨丙泊酚调控PI3K/AKT信号通路对肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法传代培养人肺癌A549细胞株,根据细胞培养基中添加丙泊酚浓度的不同分为control组(未添加丙泊酚)、pL组(添加丙泊酚1.5μg/ml)和pH组(添加丙泊酚2.2μg/ml);克隆形成实验、细胞划痕实验及流式细胞术检测丙泊酚对肺癌细胞增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响,qRT-PCR和Western blot检测丙泊酚对PI3K/AKT信号通路相关蛋白(PTEN、PI3K、AKT和mTOR)表达的影响。采用苯并芘诱导雄性A/J小鼠肺癌模型,造模成功的小鼠被随机分为c组(腹腔注射0.9%氯化钠注射液)、p1组(腹腔注射丙泊酚20 mg/kg)和p2组(腹腔注射丙泊酚50 mg/kg),每组8只;观察丙泊酚对A/J小鼠体内肺癌的影响。结果与control组比较,pL组和pH组均能抑制A549细胞增殖和迁移能力,促进A549细胞的凋亡(P0.05,P0.01),且呈剂量依赖性。与control组比较,pL组和pH组均能抑制A549细胞中PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白的表达,提高PTEN mRNA和蛋白的表达(P0.01),且呈剂量依赖性。与c组比较,p1组和p2组肿瘤数量显著减少、肿瘤体积显著减小(P0.05,P0.01)。结论丙泊酚通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活,从而抑制肺癌细胞的增殖、迁移能力,并促进其凋亡。     

RNA干扰ERCC1基因对肺癌细胞药物敏感性的影响

目的探讨RNA干扰切除修复交叉互补基因1(ERCC1)对肺癌细胞药物敏感性的影响。方法将肺癌A549/DDP细胞分为阴性组、空白组、ERCC1-shRNA1组及ERCC1-shRNA2组,通过不同方法检测分析ERCC1的mRNA和蛋白表达水平,及不同顺铂(DDP)浓度下肺癌细胞的凋亡程度。结果阴性组、空白组的ERCC1 mRNA及蛋白表达水平无显著差异(P>0.05);ERCC1-shRNA1组、ERCC1-shRNA2组的ERCC1 mRNA及蛋白表达水平与阴性组、空白组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);ERCC1-shRNA1组、ERCC1-shRNA2组的ERCC1 mRNA及蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ERCC1-shRNA 1组、阴性组、空白组的A549/DDP细胞抑制率均随着DDP浓度的升高而增加;DDP浓度为8、16、32μg/mL时,ERCC1-shRNA1组的A549/DDP细胞抑制率高于阴性组及空白组(P<0.05);阴性组、空白组的A549/DDP细胞抑制率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与0μg/mL相比,阴性组、空白组、ERCC1-shRNA 1组16、32μg/mL DDP的A549/DDP细胞凋亡率增加(P<0.05);DDP浓度为0、16、32μg/mL时,ERCC1-shRNA1组的A549/DDP凋亡率高于阴性组及空白组(P<0.05)。结论沉默ERCC1载体可减少肺癌A549/DDP细胞中ERCC1表达,可抑制肿瘤细胞增殖,增加化疗药物的敏感性。RNAi抑制交叉互补基因治疗肺癌患者的可行性高,能够为下一步临床工作提供理论基础。     

5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡的Wnt/β-catenin信号通路机制研究

【目的】探讨5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路机制。【方法】HPV阳性宫颈癌细胞SiHa随机分为对照组、低剂量组(10μmol/L 5-氟尿嘧啶)、高剂量组(40μmol/L 5-氟尿嘧啶)和Wnt抑制剂(ICG-001)组(10μmol/L ICG-001),除对照组给予无菌磷酸盐缓冲液外,其余各组分别给予对应剂量的药物。比较各组细胞的增殖、凋亡情况(凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9)及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(Wnt、β-catenin)的表达水平。【结果】5-氟尿嘧啶能明显抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖,提高细胞凋亡率和细胞凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表达水平(P<0.05);5-氟尿嘧啶处理后Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt和β-catenin的表达明显减弱(P<0.05),且随着剂量的增加,上述效果越明显(P<0.05)。【结论】5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡,可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

5-aza-dC、TSA联合MeCP2的RNA干扰质粒对人肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响

目的探讨DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞(5-aza-dC)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和甲基化结合蛋白MeCP2的RNA干扰载体Psilencer-2.1-U6-MeCP2对人肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法人肺腺癌细胞株A549细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。利用阳离子脂质体将Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒转染到A549细胞中。用5μmol/L的5-aza-dC和(或)300nmol/L的TSA处理A549细胞和稳定转染的A549细胞。Annexin V/PI双染法测定各组细胞培养72h后的凋亡情况;应用RT-PCR检测各组细胞培养72h后C/EBPαmRNA的表达。结果 (1)Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒能够稳定转染到A549细胞中;(2)5-aza-dC、TSA和Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒均能够上调A549细胞C/EBPα基因mRNA的表达、诱导细胞凋亡,且两两联合处理组A549细胞中C/EBPαmRNA的表达水平及凋亡率均明显高于单处理组(均P0.01)、细胞C/EBPαmRNA的相对表达量及凋亡率在三者联合处理组与两两联合处理组组间比较,差别均有统计学意义(P0.05);(3)5-aza-dC组、TSA组和Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒组在诱导细胞凋亡、增强C/EBPαmRNA的表达方面比较,差别均无统计学意义。结论与单用5-aza-dC、TSA、Psilencer-2.1-U6-MeCP2重组质粒相比,联合运用能够更好的诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,增强C/EBPα基因mRNA的表达,且三者联合运用的效果最显著,这将为去甲基化多药联合治疗肺癌提供理论依据。     

mTOR通路下游核心分子的mRNA表达水平与初发AML患者临床特征的关系

目的:探讨初发急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓单个核细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、真核细胞翻译启始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF-4E)及真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白1(eIF4E binding protein1,4E-BP1)mRNA表达水平与临床特征的关系。方法:采用荧光定量RT-PCR检测59例初发AML(AML组)和15名健康人(对照组)的骨髓单个核细胞中的4E-BP1、eIF-4E及mTOR mRNA表达水平,以正常人平均表达水平作为分组标准,结合AML患者的临床特征进行相关分析。结果:AML组中4EBP1、eIF-4E和mTOR mRNA高表达者分别占50.9%、59.4%和45.8%。4E-BP1高表达组PLT数显著低于4E-BP1低表达组(P=0.044);eIF-4E高表达组骨髓原始细胞比例高于eIF-4E低表达组,但差异无统计学意义(P=0.068);mTOR高表达组骨髓原始细胞比例及髓外侵犯显著高于mTOR低表达组(P=0.040,P=0.029),mTOR高表达组贫血比例高于mTOR低表达组,但差异无统计学意义(P=0.082)。结论:mTOR通路下游核心分子的mRNA表达水平与初发AML患者骨髓原始细胞增殖、PLT数、贫血及髓外侵犯关系密切,相关检测有望为制定有效安全的化疗方案以及防治贫血、出血等化疗不良反应提供参考。     

间变性大细胞淋巴瘤中AKT、mTOR途径活化的研究

目的 研究间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)患者中间变性淋巴瘤激酶(ALK)及磷酸化AKT(p-AKT)、mTOR(p-mTOR)、4E-BPI(p-4E-BPI)和p70S6K(p-p70S6K)的表达特点、临床意义及相互关系.方法 应用免疫组织化学EnVision法检测ALK蛋白及p-AKT、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6K蛋白的表达.结果 81例ALCL患者中有51例(63.0%)表达ALK蛋白,30例(37.0%)不表达,ALK阳性患者预后优于阴性患者(P<0.05).71例患者中54例(76.1%)表达p-AKT,p-AKT的表达与ALK表达相关(P<0.05);57例(80.3%)表达p-mTOR,p-mTOR的表达与ALK、p-AKT表达相关(P<0.05);64例(90.1%)表达p-4E-BP1,66例(93.0%)表达p-p70S6K,p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与p-mTOR表达相关(P<0.05),与ALK、磷酸化p-AKT表达无关(P>0.05).p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与预后无关(P>0.05).COX比例风险回归分析表明ALK的表达、体质性症状对患者生存影响有统计学意义(P<0.05),其中,ALK的表达对生存的影响最大.结论 p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1和p-p70S6K在ALCL患者中均有表达,但在ALK阳性患者中表达率显著高于阴性患者.p-AKT、P-mTOR表达与ALK表达相关,提示在ALK阳性ALCL患者中存在AKT/mTOR通路的激活,但无明显的预后意义. 无关(P>0.05).p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1及p-p70S6K的表达与预后无关(P>0.05).COX比例风险回归分 表明ALK的表达、体质性症状对患者生存影响有统计学意义(P<0.05),其中,ALK的表达对生存的影响最大.结论 p-AKT、P-mTOR、p-4E-BP1和p-p70S6K在ALCL患者中均有表达,但在ALK阳性患者中表达率显著高于阴性患者.p-AKT、P-mTOR表达与ALK表达相关,提示在ALK阳性ALCL患者中存在AKT/mTOR通路的激活,但无明显的预后意义. 无关(P>0.05).     

DOCK1通过AMPK/mTOR通路对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的调控机制研究

目的 探讨胞质分裂作用因子1(dedicator of cytokinesis 1,DOCK1)在多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）中的表达及其对癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及相关机制。方法 选取MM患者骨髓组织及人MM细胞株U266和RPMI 8266进行研究,采用实时荧光定量PCR(real time-quantitative PCR,RT-qPCR)法检测MM骨髓组织及细胞中DOCK1相对表达;构建敲低DOCK1表达细胞系,采用CCK-8法和流式细胞术检测DOCK1对MM细胞增殖与凋亡的影响;Western blot实验检测细胞增殖相关蛋白（c-Myc,cyclin D1）、凋亡相关蛋白（Bax,Bcl-2）、自噬相关蛋白（LC3-II/LC3-I,P62）及AMPK/mTOR通路相关蛋白的表达水平。结果 LV-DOCK1-shRNA2组的U266和RPMI8266细胞增殖率在24,48和72h均显著低于空白对照组和阴性对照组,差异均有统计学意义（FU266=21.130～100.108,FRPMI8266=35.067～95.677,均P<0.001）...     

人胚胎干细胞Pten基因表达及PI3K/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的磷酸化

背景:各种磷酸化蛋白质表达水平对人胚胎干细胞维持未分化状态或定向分化的影响逐渐成为人胚胎干细胞的研究热点,研究发现磷酸化蛋白质表达水平可能决定着人胚胎干细胞的命运。目的:对PI3K/Akt途径下游的关键蛋白磷酸化水平进行检测,寻找PI3K/Akt途径中能够维持人胚胎干细胞未分化状态的下游蛋白。方法:用胎鼠成纤维细胞作为饲养层,二维培养的方法培养人胚胎干细胞,胶原酶消化后待测;以饲养层细胞、K562细胞株为对照。观察人胚胎干细胞生长状态;RT-PCR检测Pten基因表达;WesternBlot检测p-PTEN、p-mTOR、p-P70S6Kp-4E-BP14种蛋白的表达。结果与结论:人胚胎干细胞在未分化状态时PtenmRNA表达高于肿瘤细胞K562,而且Pten抑制的mTOR信号通路中关键蛋白表达均明显低于K562,尤其以p-4E-BP1表达最低。提示PI3K/Akt/mTOR信号通路下游磷酸化蛋白在人胚胎干细胞活性较低,如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白,可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡,进而为定向分化、再生医学提供更多的细胞来源。     

Saikosaponin a functions as anti-epileptic effect in pentylenetetrazol induced rats through inhibiting mTOR signaling pathway

ObjectiveSaikosaponin a (SSa), which is one major bioactive compound isolated from radix bupleuri, has been demonstrated to exhibit the properties of anticonvulsant and antiepileptic in few reports. This study aims to clarify the molecular mechanism by which SSa protects against pentylenetetrazol (PTZ) induced epileptic seizure.MethodsPTZ induced rat and hippocampal neuron were established. Treated rats or hippocampal neuron with SSa, and mTOR, P70S6K, IL-1β and TNF-α were then determined.ResultsIn PTZ induced rat, SSa significantly reduced seizure severity and duration while markedly elevated seizure latency, and it also down-regulated hippocampal p-mTOR, p-70S6K, L-1β and TNF-α expression. In hippocampal neurons exposed to PTZ, p-mTOR and p-70S6K expression levels were also decreased by SSa. Pre-incubated hippocampal neurons with leucine, an mTOR agonist, reversed the effects of SSa on decreasing cytokines expression and inhibiting cell apoptosis. The treatment of mTOR inhibitor rapamycin prevented against the increase of cytokines expression and hippocampal neuron apoptosis induced by PTZ. Leucine also canceled the alleviation of seizures and induction of hippocampal caspase-3 activity in PTZ induced rat with the treatment of SSa.ConclusionSSa protects against PTZ induced epileptic seizure and hippocampal neuron apoptosis through inhibiting mTOR signaling pathway.     

有氧运动对大鼠骨骼肌mTOR活性与蛋白表达的影响

目的：观察有氧运动对大鼠骨骼肌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白总量（t-mTOR）及磷酸化mTOR（p-mTOR）与磷酸化的核糖体蛋白S6激酶（p-P70^S6K）的影响。方法：SD大鼠随机分为对照组和运动组。运动组1.5h/d训练,共7周。运动结束后分别在24h或48h取材,测定葡萄糖和胰岛素浓度;Western blot法检测骨骼肌t-mTOR蛋白表达、p-mTOR和p-P70^S6K磷酸化水平。结果：与对照组比较,运动组胰岛素浓度降低;各运动组t-mTOR升高;p-mTOR和p-P70^S6K活性增高显著。结论：运动能提高大鼠骨骼肌对胰岛素的敏感性,改善mTOR与P70S6K磷酸化及mTOR蛋白表达。     

T淋巴细胞内mTOR/S6途径在难治/复发再生障碍性贫血发病机制中的作用

目的 研究难治/复发再生障碍性贫血(AA)患者骨髓T淋巴细胞内雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/核糖体蛋白S6途径活化情况,以及mTOR抑制剂雷帕霉素(RAPA)和CD28抗原阻断剂CTLA-4免疫球蛋白(CTLA-41g)对此途径的影响.方法 采集13例难治/复发AA、8例初治重型AA(SAA)以及1O例缺铁性贫血(IDA)患者(对照组)的骨髓标本,加入RAPA和CTLA-41g进行孵育,用流式细胞术检测加药前后每组患者CD3+T淋巴细胞胞质内磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化S6(P-S6)和干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平,并分析其与疾病的关系.结果 ①难治/复发AA组患者骨髓CD3+T细胞胞内p-mTOR、P-S6及IFN-γ的表达水平较对照组显著升高(P值均＜0.01).②初治SAA患者p-mTOR和p-S6的表达水平低于难治/复发AA组(P值均＜0.01),而与对照组比较差异无统计学意义(P值均＞0.05);初治组IFN-γ的表达水平明显高于对照组(P值均＜0.01).③RAPA和CTLA-41g作用后,难治/复发AA患者p-mTOR、p-S6及IFN-γ的表达水平较用药前明显下降(P值均＜0.01).结论 CD3+T淋巴细胞内mTOR/S6途径在难治/复发AA患者中活化.RAPA和CTLA-41g均可抑制难洽/复发AA患者体内mTOR/S6途径,并下调IFN-γ.CD28/mTOR/S6和IFN-γ途径参与难治/复发AA的免疫发病机制,并且对RAPA和CTLA-41g敏感,以CD28、mTOR为治疗靶点,临床应用RAPA和CTLA-4Ig治疗此类AA患者值得探索.     

自噬作用在早产儿视网膜病变大鼠病情进展中的调控作用及相关机制研究

目的探讨自噬作用在早产儿视网膜病变大鼠病情进展中的调控作用及相关机制。方法20只SD大鼠随机选取10只孕鼠正常分娩,不做任何特殊处理,待其顺利分娩后选取20只足胎龄幼鼠进行下一步实验;另取10只孕鼠采用脂多糖(LPS)制备早产模型,诱导孕鼠早产,取20只早产幼鼠。将所得幼鼠平均分为正常分娩+空气组、正常分娩+视网膜病变组、早产+空气组、早产+视网膜病变组,每组各10只。对比分析各组大鼠视网膜无血管区和新生血管区面积大小、视网膜血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)表达水平以及白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量;同时检测幼鼠视网膜组织中自噬小体数量、自噬相关蛋白和Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平。结果相较于正常分娩+空气组,正常分娩+视网膜病变组、早产+空气组、早产+视网膜病变组血管区和新生血管区面积、VEGF和IGF-1 mRNA表达水平、IL-1β和IL-6含量和P62、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平均有所上调,自噬小体数量和自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和ATG5表达水平则有所下降,尤其是以早产+视网膜病变组最为显著(P<0.05)。结论早产儿视网膜病变大鼠病情进展与视网膜组织自噬活性降低有关,且作用机制可能通过Akt-mTOR信号通路调控自噬相关蛋白表达而实现。     

竹节香附素A通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察竹节香附素A（RDA）对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法 分别使用0、5、10、20及40μmol/L的RDA干预HeLa细胞48 h,CCK-8实验测定细胞增殖率,计算半抑制浓度（IC₅₀）,确定药物浓度。流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白免疫印迹法检测细胞中B细胞淋巴瘤2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、活化胱天蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的蛋白表达水平。将HeLa细胞分为4组,即空白对照组、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）组、RDA组和联合用药组,检测及比较各组细胞增殖率、凋亡率和p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量。结果 随着RDA浓度的增加,HeLa细胞的增殖率降低、凋亡率升高（P均< 0.05）,Bax、Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量升高（P均< 0.05）,Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量降低（P均< 0.05）;IGF-1激活PI3K/Akt/mTOR信号通路后,RDA仍然能抑制HeLa细胞增殖（P均< 0.05）,降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量（P均< 0.05）。结论 RDA可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对人宫颈癌HeLa细胞产生抑制增殖与促进凋亡的效果。     

血小板源性生长因子-DD通过Akt信号通路促进膀胱癌T24细胞增殖

目的研究外源性血小板源性生长因子-DD(PDGF-DD)对膀胱癌T24细胞增殖及Akt信号转导通路的影响,阐述factor其诱导细胞增殖的机制。方法外源性PDGF-DD蛋白作用T24细胞,采用MTT法分析细胞的增殖;流失细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot法观测膀胱癌T24细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR以及核因子NF-κB蛋白表达的变化。结果 PDGF-DD促进T24细胞的增殖,并且具有浓度依赖性;DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例下降,合成期(S期)细胞比例上升;Akt、mTOR表达变化不明显,而p-Akt、p-mTOR及NF-κB p65的表达均上调。LY294002抑制PI3K/Akt及其下游靶位蛋白磷酸化;雷帕霉素和PDTC分别抑制p-mTOR和NF-κBp65的表达。结论外源性PDGF-DD刺激T24细胞的增殖,其机制可能是通过Akt/mTOR和Akt/NF-κB两条独立的信号通路实现的。     

siRNA前体慢病毒干扰A549细胞株蛋白激酶2a表达的载体构建及鉴定

目的构建针对蛋白激酶2a（caseinkinase2a,CK2a）基因的siRNA前体（shortharpinRNA,shRNA）表达载体,鉴定CK2a基因干扰效率。方法体外设计并合成针对CK2a基因的慢病毒shRNA干扰载体,通过PCR及测序证实载体构建成功。将人肺腺癌细胞株A549分为3组,病毒干扰组（CK组）将慢病毒颗粒以最适滴度感染细胞株A549,病毒空载组（NC组）将慢病毒颗粒空载体感染细胞株A549,阴性对照组（CON组）为未经任何处理的细胞株A549;检测各组CK2a的干扰效率。结果构建的慢病毒载体序列通过PCR、测序等鉴定证实与设计序列相同;实时定量PCR检测显示CK组A549细胞CK2amRNA表达率较NC组及CON组下降约80％;Westernblotting显示CK组A549细胞表达CK2a蛋白量较NC组及CON组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株CK2a基因的表达。