siRNA介导的hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞凋亡的影响

目的　应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白hPOT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞凋亡的影响。方法利用先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsRNA)的3种重组siRNA表达质粒,由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT PCR和电泳迁移率变化分析法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过流式细胞术、Hoechst荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果　不同hPOT1特异性序列的3种的重组质粒转染HeLa细胞4 8h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平降低,细胞凋亡水平明显增加。结论　siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达下调导致HeLa细胞凋亡     

siRNA介导hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞Caspase-3的影响

目的应用siRNA表达载体介导的RNA i技术,特异地抑制端粒保护蛋白POT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞Caspase-3活化的影响。方法利用作者课题组先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsDNA)的3种重组siRNA表达质粒(pmU6-shRNA1、pmU6-shRNA2和pmU6-shRNA3),由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT-PCR和EM-SA法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过RT-PCR、W estern b lot和Caspase-3检测试剂盒分析Caspase-3表达和活化。结果3种pmU6-shRNA重组质粒转染HeLa细胞48 h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平均降低,Caspase-3 mRNA表达水平基本无变化,Caspase-3酶原水平降低,而Caspase-3酶活性增高。结论siRNA表达载体介导的RNA i能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达的抑制导致细胞Caspase-3活化。     

siRNA干扰CASK表达对INS-1细胞胰岛素分泌的影响

目的 探讨小分子RNA(siRNA)干扰CASK基因表达对大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的影响.方法 用脂质体lipofectamine 2000将针对靶基因CASK合成的特异性siRNA片段转染INS-1细胞.实时定量PCR及Western blot检测CASK基因表达变化,进行有效干扰片段的筛选.放射免疫法检测钾离子刺激胰岛素分泌(KSIS)功能的改变.结果 转染100 nM siRNAs 48 h后,INS-1细胞中CASK基因表达明显降低(P＜0.01),KSIS功能显著降低(P＜0.01).结论 靶向siRNA可以特异性地抑制INS-1细胞中CASK基因表达,从而抑制钾离子诱导的胰岛素分泌.     

抑制Bmi-1基因表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的利用小干扰RNA技术沉默Bmi-1基因的表达,探讨其对人鼻咽癌CNE-1生物学行为的影响。方法设计并化学合成了针对Bmi-1的小干扰RNA,转染具有高转移性的CNE-1细胞,利用qRT-PCR和Western blot分别检测Bmi-1基因mRNA和蛋白的表达水平。体外通过Transwell小室、Matrigel胶模型﹑流式细胞术,观察Bmi-1被沉默后对鼻咽癌细胞株CNE-1生物学行为的影响。结果 qRT-PCR和Western结果显示,Bmi-1-siRNA转染组Bmi-1基因的表达水平被有效抑制。与对照组相比,Bmi-1-siRNA转染组的细胞侵袭迁移力明显下降,细胞被阻滞在S期。结论抑制Bmi-1基因的表达可有效降低CNE-1细胞侵袭迁移的能力。     

hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响

目的研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性。结果hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制。转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mRNA和蛋白表达及端粒酶活性。     

靶向抑制人SREBP-1基因对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂滴形成的影响

目的构建人SREBP-1基因的shRNA载体并转染人肾小管上皮细胞(HKC)明确是否沉默SREBP-1基因的表达可减轻高糖环境引起的细胞内脂滴形成。方法设计两对针对人SREBP-1基因的干扰靶序列及短链寡核苷酸和线性化的pGenesil-1质粒进行连接,筛选鉴定并最终命名为pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2。体外培养人肾小管上皮细胞并随机分组,采用阳离子脂质体法转染细胞后给予高糖刺激48h,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果经酶切及测序鉴定证明构建的重组载体pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2序列正确;转染HKC细胞后均可表达绿色荧光;RT-PCR和Westernblot显示pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2能够有效抑制高糖环境下HKC细胞SREBP-1的表达,与阴性质粒对照组相比,差异有统计学意义。进一步研究发现在HKC细胞内,SREBP-1基因表达沉默明显抑制了脂肪酸合成酶(FAS)的转录,细胞内脂滴明显减少。结论有效沉默高糖刺激下HKC细胞SREBP-1的基因表达可通过抑制FAS转录而减少细胞内脂滴形成。     

腺病毒介导的RNAi抑制Cbfa1表达阻断软骨细胞肥大分化的实验研究

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术来抑制核心结合因子(core binding factor α 1,Cbfa1)表达,从而阻断软骨细胞肥大分化目的.方法:构建沉默SD大鼠核心结合因子基因的腺病毒(Ad-Cbfa1-siRNA).利用维甲酸及IL-1α促进软骨细胞肥大分化,研究Ad-Cbfa1-siRNA对Cbfa1表达的抑制作用.利用Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原免疫组化的方法以及RT-PCR比较各组之间Cbfa1的表达情况来分析软骨细胞的肥大分化情况.结果:结果显示,软骨细胞经维甲酸和IL-1 α 诱导后,Cbfa1的表达量明显增加,经统计学分析,P＜0.05,具有统计学意义.阴性对照病毒组Cbfa1的表达量明显高于Ad-Cbfa1-siRNA组,经统计学分析,P＜0.05,具有统计学意义.结论:利用RNAi技术能够明显的抑制Cbfa1的表达,从而阻断软骨细胞的肥大分化.     

RNAi抑制肺癌细胞H MGA1基因表达对放射敏感性的影响

目的 探讨慢病毒介导核糖核酸干扰(RNAi)抑制高迁移率族蛋白A1(HMGA1)表达对肺癌细胞株SPCA-1放射敏感性的影响.方法 将前期制备的HMGA1 siRNA慢病毒载体转染肺癌细胞SPCA-1;半定量RT-PCR和Western blot分别检测HMGA1 mRNA及蛋白表达情况;细胞克隆形成实验、多靶单击模型拟合绘制细胞存活曲线观察细胞放射敏感性的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 RT-PCR和Western blot证实阳性组细胞HMGA1基因表达下调;细胞存活曲线显示阳性组细胞平均致死剂量(D_0)、准阈剂量(Dq)及2Gy照射后的细胞存活分数(SF_2)均为高于对照组及阴性组(P<0.05);流式细胞术检测阳性组细胞凋亡率则均低于对照组及阴性组(P<0.05).结论 HMGA1 siRNA特异性地下调SPCA-1细胞中HMGA1基因表达,可抑制细胞凋亡,并降低细胞的放射敏感性.     

PARP1基因抑制对卵巢癌细胞增殖及耐药性的影响

目的研究PARP-1基因在卵巢癌化疗耐药发生中的作用以及PARP-1小干扰RNA对紫杉醇耐药卵巢癌细胞增殖的影响。方法使用紫杉醇刺激紫杉醇耐药卵巢癌细胞SKOV3/TAX及敏感细胞SKOV3,应用小干扰RNA(siRNA)技术抑制PARP-1基因的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测紫杉醇单独以及联合PARP siRNA对卵巢癌细胞增殖的影响。结果 SKOV3/TAX细胞中PARP-1表达高于SKOV3细胞;紫杉醇可以减少SKOV3细胞中PARP-1的表达和抑制细胞的增殖,而对SKOV3/TAX细胞无明显作用;PARP-1 siRNA可以明显增强紫杉醇对卵巢癌细胞增殖的抑制作用,逆转SKOV3/TAX细胞对紫杉醇的耐药性。结论 PARP-1在卵巢癌细胞表达水平与耐药性密切相关;PARP-1基因抑制可以增强紫杉醇对SKOV3增殖的抑制,逆转SKOV3/TAX对紫杉醇的耐药性。     

Genistein enhances the effect of trichostatin A on inhibition of A549 cell growth by increasing expression of TNF receptor-1

Our previous study has shown that genistein enhances apoptosis in A549 lung cancer cells induced by trichostatin A (TSA). The precise molecular mechanism underlying the effect of genistein, however, remains unclear. In the present study, we investigated whether genistein enhances the anti-cancer effect of TSA through up-regulation of TNF receptor-1 (TNFR-1) death receptor signaling. We incubated A549 cells with TSA (50 ng/mL) alone or in combination with genistein and then determined the mRNA and protein expression of TNFR-1 as well as the activation of downstream caspases. Genistein at 5 and 10 μM significantly enhanced the TSA-induced decrease in cell number and apoptosis in a dose-dependent manner. The combined treatment significantly increased mRNA and protein expression of TNFR-1 at 6 and 12 h, respectively, compared with that of the control group; while TSA alone had no effect. TSA in combination with 10 μM of genistein increased TNFR-1 mRNA and protein expression by about 70% and 40%, respectively. The underlying mechanism for this effect of genistein may be partly associated with the estrogen receptor pathway. The combined treatment also increased the activation of caspase-3 and ‐10 as well as p53 protein expression in A549 cells. The enhancing effects of genistein on the TSA-induced decrease in cell number and on the expression of caspase-3 in A549 cells were suppressed by silencing TNFR-1 expression. These data demonstrated that the upregulation of TNFR-1 death receptor signaling plays an important role, at least in part, in the enhancing effect of genistein on TSA-induced apoptosis in A549 cells.     

反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的 应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响.方法 构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株.采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及 Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期.结果 成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P＜0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M 期细胞数量分布减少.而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变.结论 成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因.     

Uptake of plasmid-loaded nanoparticles in breast cancer cells and effect on Plk1 expression

The development of nucleic acid–based drugs for cancer therapeutic application has shown promising results in the past. However the delivery of these drugs to target cells is one problem which remains to be resolved. Nanoparticles have been described as promising strategies to deliver drugs into target cells. Human serum albumin (HSA) nanoparticles conjugated to trastuzumab for a cell type–specific targeting of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-overexpressing cells were developed with incorporated expression plasmids for small hairpin RNAs (shRNAs) targeting polo-like kinase 1 (Plk1). Plk1 is a promising target for such an approach because it is overexpressed in all known cancer types and is a negative prognostic factor. Receptor-mediated uptake of the trastuzumab-modified nanoparticles into HER2-positive cells could be observed leading to reduced Plk1 expression. Taken together, HSA nanoparticles represent promising tools to deliver expression plasmids for shRNAs into target cells and should be further evaluated with regard to a therapeutic application of RNA interference in cancer therapy.     

MACC1基因下调对胃腺癌细胞的生长抑制作用

目的研究下调MACC1 表达对胃腺癌细胞株MGC-803 生长作用的影响。方法设计并合成RNAi 干扰片段,脂质体介导MACC1-siRNA1（MACC1-siRNA1 组）和MACC1-siRNA2（MACC1-siRNA2 组）转染MGC-803 细胞,同时设非特异性干扰片段为对照组。应用qRT-PCR 检测转染后各组MACC1 的mRNA 表达,噻唑蓝比色实验、平板克隆形成实验和流式细胞周期实验检测RNAi 转染后MGC-803 细胞增殖能力的变化,Western blot 检测转染后MACC1、P21、CDK4、CCND1 和c-myc 蛋白的表达,并进行比较分析。结果与对照组相比,MACC1-siRNA1 组和MACC1-siRNA2 组MACC1 表达在mRNA 及蛋白水平下降,细胞的增殖速度变慢,单克隆形成数量减少,细胞周期中G1 期细胞的比例显著升高,P21 的表达增加,MACC1、CDK4、CCND1 和c-myc 的表达减少。结论下调 MACC1 能使MGC-803 细胞的细胞周期进程受阻,抑制细胞的增殖,MACC1 可以作为治疗胃癌的有效靶点。     

siRNA干扰LOXL2基因对人胃癌细胞株BGC823侵袭的影响及机制

目的 研究小干扰RNA(siRNA)抑制胃癌细胞中LOXL2的表达情况,并探讨LOXL2基因对人胃癌细胞株BGC823侵袭能力影响及机制.方法 QRTPCR及蛋白印迹(Western blot)技术检测人胃癌细胞株BGC823、正常胃上皮细胞株GES-1中LOXL2表达;合成针对LOXL2的siRNA,并转染胃癌细胞株BGC823;应用Transwell实验检测BGC823细胞侵袭能力;检测转染前后BGC823侵袭相关基因基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达变化.结果 LOXL2在BGC823细胞中的表达明显高于胃上皮细胞株(P<0?.01);与未转染和转染阴性对照质粒组相比转染组胃癌细胞BGC823中LOXL2 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),侵袭实验显示LOXL2-siRNA转染组胃癌细胞BGC823穿膜细胞数显著低于阴性对照质粒组和未转染组(P<0.05);转染后BGC823中MMP-2、MMP-9表达均较转染前降低(均P<0.05).结论 抑制胃癌细胞BGC823 LOXL2表达可降低细胞的侵袭能力.     

LAT1、CD98hc在胃癌组织中表达与临床病理特征的关系

目的:探讨L型氨基酸转运载体1(L-type amino acid transporter-1,LAT1)、CD98hc在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系.方法:采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法和免疫组织化学方法检测45例胃癌组织及45例癌旁正常组织中LAT1、CD98hc、Ki67表达.结果:RT-PCR检测显示胃癌组织中LAT1、CD98hc的表达显著高于癌旁正常组织(P＜0.05);免疫组化结果显示,LAT1在胃癌组织和癌旁组织中表达率分别为64.40％和6.67％(P＜0.01);CD98hc在胃癌组织和癌旁组织中的表达率分别为60.0％和22.2％(P＜0.01); LAT1、CD98hc 的表达在低分化组显著高于高中分化组(P＜0.05);肿瘤大小≥5 cm组显著高于＜5 cm组;在Ⅰ～Ⅱ期、淋巴结无转移组LAT1、CD98hc的表达明显比Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移组低(P＜0.01);LAT1、CD98hc与Ki67的表达水平均呈正相关(P＜0.01).结论:胃癌组织中LAT1、CD98hc具有高表达率,且表达具有高度肿瘤特异性,提示LAT1、CD98hc可能在胃癌的生长与转移中有非常重要的作用.     

强力霉素对胃癌细胞增殖及Notch1、 MMP-9表达的影响

【摘要】目的 研究强力霉素对胃癌细胞BGC-823细胞的增殖及 Notch1、MMP-9 蛋白表达的影响,为胃癌的治疗提供新的抗肿瘤药物。方法 分别以 0、5、10、20、40 μg/mL 终浓度的强力霉素作用于人胃癌细胞系 BGC-823,运用 MTT 法检测细胞增殖程度;流式细胞仪检测细胞周期分布的影响; Western Blot 检测 Notch1、MMP-9 蛋白水平的表达。结果 强力霉素能够抑制人胃癌细胞BGC-823细胞的增殖,且与药物的剂量及作用时间呈正相关（P＜0.01）;强力霉素能够改变胃癌细胞BGC-823周期的分布,随着浓度的增加,S 期所占比例降低（P＜0.01）;并且随着浓度的增加,Notch1 的表达增强,MMP-9 的表达降低（P＜0.01）。结论 强力霉素能够抑制胃癌细胞BGC-823的增殖,Notch1上调为可能的机制之一     

Rac1异常表达及变异与胃癌临床病理特征关系的研究

目的研究Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)表达及变异,探讨其与胃癌生物学行为的关系。方法以Rac1mRNA为标志基因,用RT-PCR方法检测66例患者胃癌组织、癌旁组织、11例胃良性病变中Rac1 mRNA的表达情况。应用PCR-SSCP方法显示Rac1基因存在的变异。结果66例胃癌患者的癌和癌旁组织中Rac1 mRNA表达阳性率分别为81.82%、27.27%,两组差异显著(χ2=39.6,P=0.001)。11例胃良性病变中无Rac1 mRNA的表达。胃癌组织中Rac1 mRNA平均表达水平(Md=1.641,Q75=1.967)明显高于癌旁组织(Md=0,Q75=0.024),两者差异有显著性(P<0.01)。无转移组、微转移组和转移组中Rac1mRNA表达阳性率分别为22.22%、88.67%和92.86%,三组差异显著(χ2=25.165,P=0.000)。微转移和转移组中Rac1 mRNA平均表达水平明显高于无转移组,三组差异有显著性(χ2=14.577,P=0.0007)。Rac1在不同临床分期、分化程度和胃癌淋巴结转移及微转移的标本中的阳性表达率比较,差异有显著性意义(P<0.05)。3份超水平表达Rac1的PCR产物在非变性胶中出现了明显不同的染色区带,表明它们的Rac1表达产物存在基因变异。结论Rac1 mRNA的高表达以及变异与胃癌临床病理表现密切相关,为胃癌基因治疗提供了新的靶点。