脆性组氨酸三联体基因转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体基因(FHIT)转染对人结肠癌细胞株SW480奥沙利铂敏感性的影响.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞(SW480-pRc/CMV2)和正常SW480细胞为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测FHIT基因的mRNA转录水平.以奥沙利铂作用于3组细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测奥沙利铂处理前后各组结肠癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化.结果 SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;经奥沙利铂处理后,转染FHIT基因的SW480细胞的凋亡水平与空质粒转染组及结肠癌细胞株组比较明显增高(第2、3、4天A值比较P<0.05),并且FHIT基因与奥沙利铂有轻度的协同促进凋亡作用;同时奥沙利铂处理前后实验组结肠癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性.结论 外源性FHIT基因表达与奥沙利铂协同促进SW480细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性.     

脆性组氨酸三联体基因对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨脆性组氨酸三联体基因（FHIT）转染对结肠癌细胞株SW480增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 将重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT通过脂质体转染技术导入人结肠癌细胞株SW480（实验组）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞作为阴性对照,以正常SW480细胞作为空白对照.应用MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,Western blot分析caspase-8酶原的变化,半定量RT-PCR检测caspase-8 mRNA水平的改变,肽核酸标记底物的比色法检测caspase-8的相对活性.结果 转染96 h后,实验组和阴性对照组细胞生长抑制率分别为71.7%和16.9%,G0/G1细胞比例分别为（63.3±3.5）%和（50.6±2.1）%,细胞凋亡率分别为（40.5±3.1）%和（18.6±2.6）%,caspase-8 mRNA条带光密度积分值分别为107和41,caspase-8蛋白相对活性分别为0.43和0.25;上述差异均有统计学意义（P＜0.05）.当加入FHIT抑制剂后,caspase-8蛋白相对活性恢复至对照组水平（0.22）.结论 FHIT基因转染能够明显抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖,诱导SW480细胞发生G0/G1期阻滞,其作用机制可能与caspase-8表达及活性上调有关.     

人FHIT基因的克隆及其真核表达质粒的构建

目的克隆人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc／CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc／CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank（NM_002012．1）序列完全一致。pRc／CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。     

癌胚抗原启动子正调控白细胞介素-15表达质粒载体的构建及其在肿瘤细胞中的靶向表达

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子正调控人白细胞介素-15(IL-15)真核表达质粒载体,观察其在肿瘤细胞内的靶向性表达.方法 基因克隆技术构建巨细胞病毒(CMV)启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CMV-TAT和CEA启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CEA-TAT;再以IL-2信号肽(SP)置换IL-15SP构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT;阳离子脂质体介导法体外转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染后48h细胞培养上清液中IL-15表达.结果 质粒均成功构建.ELISA检测结果:(1)以IL-2SP置换IL-15SP可提高转染细胞的IL-15表达4.8～5.9倍(P＜0.01);(2)转染SW480细胞后,CEA启动子正调控的两质粒(pHi2-IL-15-CEA-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT)与相对应的CMV启动子正调控质粒(pHi2-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT)之间的IL-15表达无统计学意义(P＞0.05),其效应等同于CMV启动子正调控质粒;(3)转染MCF-7细胞后,CEA启动子正调控的两质粒IL-15表达显著低于CMV启动子正调控质粒(P＜0.01).结论 CEA启动子正调控IL-15质粒,尤其是质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT在CEA阳性细胞中高表达IL-15,CEA阴性细胞中低表达IL-15,实现了IL-15基因高效、靶向性表达.     

RNA干扰survivin联合X线放射对大肠癌SW480细胞的影响

目的探讨RNA干扰技术和X线放射处理对大肠癌细胞survivin基因表达的影响。方法合成靶向人survivin基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,联合或不联合放射治疗。检测转染前后及放射前后细胞survivinmRNA的表达;细胞抑制率及凋亡率,细胞周期分布,细胞survivin蛋白的表达。结果转染survivinsiRNA后的SW480细胞survivin mRNA及蛋白的表达明显低于对照组;SW480细胞转染survivinsiRNA 48 h后G2/M期细胞达(20.90±2.62)%,survivinsiRNA联合放射处理组细胞生长抑制率达59.8%,FCM显示survivinsiRNA联用放射处理组细胞凋亡率达(35.72±1.07)%。结论靶向survivin的siRNA能有效抑制大肠癌细胞SW480 survivin基因的表达,引起大肠癌细胞SW480 G2/M周期阻滞,抑制大肠癌细胞SW480的生长并能诱导其凋亡,并对大肠癌细胞SW480具有放射增敏作用。     

IL-18基因转染大肠癌细胞及对其肿瘤原性改变的研究

目的：建立转染人白细胞介素-18（hIL-18）基因的大肠癌细胞株,并研究IL-18基因转染后SW480细胞肿瘤原性的改变。方法：将携带hIL-18的质粒pcDNA3.1-hIL-18转导入人大肠癌细胞系SW480细胞中,通过药物G-418进行筛选,利用RT-PCR和ELISA法对IL-18的表达进行检测;通过裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变。结果：IL-18基因成功转导入SW480细胞中并能顺利表达;RT-PCR电泳结果显示IL-18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转染细胞在24 h内分泌IL-18的含量是（145.71±4.42）pg;空载体转染的细胞未检测到hIL-18;生长曲线显示转染hIL-18基因后的细胞生长明显减慢;黏附曲线显示SW480-hIL-18组的黏附率在各个时相点均明显升高,而空载体组和空白对照组之间差异无统计学意义（P〈0.05）。裸鼠致瘤实验表明,接种SW480-hIL-18细胞的裸鼠肿瘤体积明显小于SW480组和SW480-pcDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的SW480-pcDNA3.1细胞和SW480-hIL-18细胞免疫接种裸鼠后,再接种SW480细胞于裸鼠左侧背部皮下,SW480-hIL-18细胞免疫接种组肿瘤长出的时间比SW480-pcDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,并且肿瘤的生长速度明显低于SW480细胞免疫接种组。结论：hIL-18基因能成功整合到SW480细胞基因组中,并且能在转染的肿瘤细胞中持续表达。hIL-18基因转导后的SW480细胞生长受到抑制,黏附能力增强h,IL-18基因转染降低了SW480细胞的肿瘤原性;hIL-18基因修饰的SW480细胞具有明显的抗肿瘤作用,为大肠癌基因工程肿瘤疫苗的研制提供了实验基础。     

Stat3显性负性基因调控人结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

目的 探讨转染Stat3（转录信号传导子和激活子3）显性负性基因Stat3β质粒阻断人结肠癌细胞系SW480细胞的Stat3信号传导通路对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制.方法 应用阳离子脂质体向人结肠癌细胞系SW480细胞中转染携带Stat3β基因的质粒,四唑盐法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,反转录聚合酶链反应检测Stat3靶基因cyclinD1、bcl-xL mRNA表达情况.数据统计分析采用独立样本t检验.结果 转染Stat3β质粒36 h后,SW480细胞的增殖受到显著抑制（t=5.216,P=0.006）;G0/G1期的细胞比例由40.37%上升至67.25%,S期细胞由44.68%下降至31.23%;发生早期凋亡的细胞比例由5.34%上升至24.42%;同时cyclin D1、bcl-xLmRNA表达水平较对照组显著下降（t=5.228,P=0.010;t=3.517,P=0.025）.结论 转染携带Stat3β基因的质粒可以通过下调Stat3靶基因的表达抑制人结肠癌细胞的增殖,促进凋亡,为以Stat3为靶点的结肠癌基因治疗提供了实验基础.     

siRNA靶向抑制GHR对人结肠癌SW480细胞增殖的影响

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人结肠癌SW480细胞人生长激素受体(GHR)基因的表达,观察GHR基因沉默对SW480细胞增殖的影响。方法设计特异性siRNA,构建针对人GHR真核质粒的表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFP-siRNA-GHR),用电转染法转染人结肠癌SW480细胞,培养48~72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;Western Blot检测GHR蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测GHRmRNA水平变化。结果转染siRNA后,与对照组相比,转染组细胞增殖速率、GHR的蛋白表达量、GHRmRNA水平均明显降低(均P<0.05)。结论构建的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-GHRsiRNA能有效地下调SW480细胞中GHR的表达,从而抑制SW480细胞的增殖。     

hTERT|CEA及CMV启动子在人结肠癌细胞株中的转录活性比较

目的：比较人端粒酶催化亚单位（hTERT）,癌胚抗原（CEA）及巨细胞病毒（CMV）启动子在人结肠癌细胞株LoVo和SW480中的转录活性。 方法：设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆hTERT和CEA启动子;用双酶切和PCR法切除原始载体pLVX-EGFP-3FLAG中的CMV启动子后,将hTERT,CEA启动子与该载体重组,构建出重组质粒pLVX-hTERTp-EGFP-3FLAG和pLVX-CEAp-EGFP-3FLAG;将上述两种质粒及原始载体（含CMV启动子）分别瞬时转染人结肠癌细胞株LoVo和SW480后,检测两种细胞株绿色荧光蛋白表达。 结果：经PCR,酶切及测序鉴定,克隆及载体构建完全正确。CMV,hTERT及CEA启动子的转录活性（绿色荧光细胞数/总细胞数）在LoVo细胞中依次为54.7%,33.0%,9.5%;在SW480中依次为16.5%,10.1%,8.5%,差异均有统计学意义（均P<0.05）。 结论：在人结肠癌细胞株中,转录活性以CMV启动子最高,hTERT启动子次之,CEA启动子最低。该结果可为结肠癌的靶向性基因治疗研究提供参考。

     

靶向CTNNB1的shRNA抑制结肠癌SW480细胞增殖的研究

目的探讨靶向CTNNB1的shRNA对人结肠癌SW480细胞的基因下调效应和细胞增殖的抑制作用.方法构建靶向CTNNB1的shRNA载体质粒,然后转染入结肠癌SW480细胞.用RT-PCR和Western blotting方法检测CTNNB1的mRNA和蛋白的表达情况.MTT实验评价转染后各组细胞的增殖情况,并用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡情况.结果靶向CTNNB1的shRNA能够明显下调CTNNB1 mRNA和蛋白质表达（P＜0.05）,其抑制率分别是43.87%和45.16%.MTT实验提示CTN组细胞在转染后呈现随着时间延长而进行性增殖抑制的现象.在转染后72 h,CTN组的细胞存活率为46.4%,与空白对照组相比有显著性降低（P＜0.05）.而流式细胞仪显示CTN组细胞有明显G0/G1周期阻滞和凋亡率增高（P＜0.05）.结论靶向CTNNB1的特异性shRNA对结肠癌SW480细胞具有下调CTNNB1基因表达,促进细胞凋亡并且显著抑制细胞增殖的效应.     

γ-synuclein基因真核表达载体的构建及其对结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能的影响

目的构建针对γ-synuclein基因的真核表达载体并观察其对结肠癌细胞sw1116体外侵袭及与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）黏附能力的影响。方法从结肠癌细胞系HT29提取总RNA,经RT．PCR获得γ-synucleincDNA全长片段,经过酶切连接等反应定向克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1上,以脂质体转染的方法将重组质粒转染至结肠癌细胞系SW1116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。采用Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。将细胞接种于铺有HUVEC的96孔板中,酶标仪读取荧光强度来表示黏附细胞的相对数。结果成功构建pEGFP-γ-synuclein真核表达载体,经过筛选后可在SW1116细胞中稳定表达,且能在体外翻译出GFP-γ-synuclein融合蛋白质。转染γ-synuclein后,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的细胞数明显增加（198．4±20．7比98．8±13．2,P〈0．05）,与HUVEC黏附的细胞数（荧光强度）亦显著增加（3．08±0．36比1．22±0．21,P〈0．05）。结论γ-synuclein可显著增强结肠癌细胞SW1116体外侵袭转移潜能。     

萝卜硫素对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭及Notch通路的影响

目的研究萝卜硫素（SFN）对人结肠癌SW480细胞增殖、侵袭及Notch通路的影响。 方法MTT法测定不同浓度SFN对SW480细胞生长抑制作用,Transwell侵袭实验测定1、2、5 μmol/L SFN对SW480细胞体外侵袭能力的影响,划痕实验测定1、2、5 μmol/L SFN对SW480细胞体外迁移能力的影响,Western blotting法测定1、2、5 μmol/L SFN处理后SW480细胞Notch、Hes1、Ki-67、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、E-cadherin蛋白表达水平。 结果与对照组比较,1、2、5、10、20、40 μmol/L SFN处理后均能显著抑制SW480细胞增殖（P<0.05）。5 μmol/L SFN作用48 h后对SW480细胞抑制率为（26.38±3.24）%,细胞活力大于70%,为防止SW480细胞活力过低导致侵袭实验和划痕实验出现假阳性结果,因此后续实验选取SFN浓度1、2、5 μmol/L进行。侵袭和迁移实验发现,与对照组比较,人结肠癌SW480细胞经1、2、5 μmol/L SFN处理48 h后侵袭能力、迁移能力、Ki-67、PCNA、MMP-9蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,呈浓度依赖性;与对照组比较,人结肠癌SW480细胞经1、2、5 μmol/L SFN处理48 h后,Notch、Hes1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。 结论SFN可能通过阻断Notch通路活化,下调Hes1表达水平,达到抑制结肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭的目的。     

TrkB影响结肠癌细胞SW620侵袭能力及与ERK信号通路活化关系的研究

目的:探讨干扰结肠癌细胞TrkB蛋白表达及抑制ERK活化对细胞增殖、凋亡和侵袭以及细胞内ERK磷酸化水平的影响。方法:应用特异性TrkB-siRNA瞬时转染及ERK特异性抑制剂处理SW620结肠癌细胞,观察SW620细胞增殖、凋亡和侵袭情况以及细胞内ERK磷酸化水平的变化。结果:特异性siRNA转染高表达TrkB的SW620细胞,TrkB蛋白表达减少,ERK的磷酸化水平降低,且转染组细胞数显著低于对照组(P=0.001),转染组的细胞凋亡率显著高于对照组(P=0.000 1),24 h后侵袭至下层小室的细胞数转染组显著低于对照组(P=0.001);ERK抑制剂明显降低SW620细胞ERK磷酸化水平(P=0.001),而对ERK蛋白表达没有影响,且应用ERK抑制剂作用SW620细胞,对照组和处理组中细胞数没有显著差异(P=0.544),对照组和处理组中SW620细胞的凋亡率差异无统计学意义(P=0.103),但对照组24 h后侵袭至下层小室的细胞数显著高于处理组(P=0.0001)。结论:干扰TrkB蛋白表达能够降低高转移结肠腺癌SW620细胞内ERK磷酸化水平,促进细胞凋亡并抑制细胞增殖和侵袭。同时应用ERK特异性抑制剂也显著抑制细胞侵袭。因此ERK信号转导通路可能与TrkB介导的结肠腺癌细胞抗凋亡和侵袭能力的增加相关,沉默TrkB表达可能成为阻断结肠癌转移的新靶点。     

Cortactin过表达对结肠癌细胞转移能力的影响

目的:通过诱导皮层肌动蛋白(cortactin)的过表达分析其在结肠癌细胞侵袭迁移以及肝转移过程中的作用。方法:构建含CTTN基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体,转染293T细胞。取含CTTN基因和绿色荧光蛋白的病毒上清液转染结肠癌细胞株SW1116使cortactin稳定表达。蛋白印迹实验检测cortactin的表达,通过Transwell实验评估结肠癌细胞侵袭迁移能力的改变。利用SW1116细胞株使裸鼠皮下成瘤,取肿瘤组织种植新一批裸鼠结肠壁并观察结肠癌肝转移的情况。结果:成功构建cortactin过表达的SW1116细胞。侵袭和迁移实验中,过表达组穿膜细胞数分别为(147±12)个、(286±17)个,而阴性对照组为(83±10)个、(112±11)个,空白对照组为(75±7)个、(103±9)个,后两组与过表达组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:上调cortactin的表达能显著促进结肠癌细胞的侵袭迁移和肝转移能力,提示cortactin在结肠癌的转移过程中发挥重要作用。     

氟尿嘧啶对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响

目的观察氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞ABCG2表达的影响。方法用不同药物浓度的5-FU处理SW480细胞,用CCK8法检测5-FU在SW480中的IC50,流式细胞仪检测SW480细胞ABCG2的阳性表达率．RT—PCR检测ABCG2的mRNA在SW480细胞中的表达差异。结果5-FU对SW480细胞的IC50随着药物浓度的增加而升高（P〈0．05）。流式细胞仪检测发现,正常SW480细胞（A组）中ABCG2阳性表达率为（6．26±0．86）％;在药物处理48h后即刻检测时（B组）的阳性表达率下降至（3．43±1．18）％（P〈0．05）;在药物处理48h后的第2代细胞检测时（c组）则升高至（12．91±3．42）％（P〈0.05）。3组ABCG2mRNA表达趋势与流式细胞仪检测结果的趋势一致。结论不同浓度的5-FU可以影响人结肠癌SW480细胞ABCG2的表达。     

干扰素α2a对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶表达和5＇脱氧氟尿苷抗癌活性的影响

目的探讨干扰素-α2a（IFN-αt2a）对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶（TP）mRNA表达水平以及5＇-脱氧氟尿苷（5’-DFUR）和氟尿嘧啶（5-FU）抗癌效应的影响。方法不同剂量IFN-α2a分别处理人结肠癌细胞LOVO和SW480．荧光定量PCR检测TPmRNA表达水平：MTT法检测联合应用IFN-α2a前后5．FU和5＇-DFUR对LOVO和SW480抑制作用的半数有效浓度（IC50）变化情况。结果与0U／mlIFN-α2a浓度组相比．500U／ml及5000U／ml组可明显上调LOVO和SW480细胞TPmRNA表达（P〈0．01）,而50U／ml则对上述两种细胞TPmRNA表达水平无明显影响（P〉0．05）。联合应用浓度为20U／ml的IFN-α2a后．5．FU对LOVO和SW480细胞的IC50无明显改变（P〉0．05）．但5’-DFUR的IC50则明显降低（P〈0．05）。结论IFN-α2a能上调结肠癌细胞TPmRNA的表汰水平并可使5＇-DFIIR对结肠痛细胞的1C50明显下降而对5-FI7则无明显影响。