IgY双抗体夹心ELISA法现场诊断血吸虫病的研究

目的 评价IgY的双抗体夹心ELISA法(S-ELISA)现场诊断血吸虫病的价值.方法 用Lowry法检测包被物的含量,将抗SEA的IgY包被酶标反应板,用棋盘滴定法确定最适抗体包被量以及血清稀释度,建立S-ELISA .以改良加藤厚涂片法 (Kato-Katz法) 检测结果为金标准,采用S-ELISA方法检测血吸虫病流行区部分人群血清循环抗原,并同时用SEA-IHA检测循环抗体,比较两者的敏感性和特异性.结果 检测疫区人群174例,Kato-Katz法、S-ELISA和SEA-IHA阳性率分别是6.90%、22.41%和15.52%,经χ2 检验,P＜0.01,差异有极显著性意义;S-ELISA与SEA-IHA比较,两种方法的敏感性和特异性之间的差异无显著性意义(P＞0.05).结论 S-ELISA诊断血吸虫病具有较好的敏感性和特异性,可以用于疫区筛查血吸虫病.     

日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的应用研究

目的 探讨日本血吸虫快速酶联免疫吸附试验（F-ELISA）抗体检测试剂盒检测日本血吸虫病的特异性、敏感性及与其他寄生虫病的交叉反应。方法 采用F-ELISA法检测日本血吸虫急性、慢性及晚期病人血清中抗SEA抗体和健康人、并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病患者血清中的交叉抗体。结果 检测急性、慢性及晚期血吸虫病人的敏感性分别为100%、95.19%和77.78%，检测正常人的特异性为98.46%，与并殖吸虫、肝吸虫、囊虫及旋毛虫病人的交叉反应率分别为11.63%、7.55%、0和13.33%。结论 F-ELISA检测日本血吸虫病具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点，具有较高的现场查病和临床诊断血吸虫病的应用价值。     

日本血吸虫天冬酰胺酰基内肽酶编码基因表达及诊断应用

目的克隆和表达日本血吸虫天冬酰胺酰基内肽酶（Sj32）,探索该重组抗原在动物血吸虫病诊断方面的应用潜能。方法用PCR法从Sj32前体编码基因中克隆编码成熟体的基因片段,以pET-28（a）为表达载体,用大肠埃希菌表达,制备重组抗原（rSj32）;应用ELISA方法检测待检血清,并比较rSj32、日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）以及重组诊断抗原rSj23对人工感染兔、小鼠及水牛血吸虫病的检测效果。结果成功表达了Sj32成熟体,表达产物rSj32的分子量为41 kDa,可用H is柱纯化,得率约为68.8 mg/L培养物。用rSj32检测人工感染兔、小鼠和水牛血清以及对照兔、小鼠和水牛血清,特异性分别为100.0%、96.7%和96.9%,敏感性分别为88.9%、85.0%和71.8%,该抗原对牛血清的敏感性略低于SEA和rSj23,其余检测结果三者相比无显著差异。结论rSj32在诊断动物血吸虫病方面具有研究和应用价值。     

重组 GST-HD融合蛋白的血吸虫病早期诊断价值

目的研究重组日本血吸虫中国大陆株23kDa膜蛋白大亲水性肽段与谷胱苷肽的融合表达蛋白(GST-HD)用于血吸虫病早期诊断的价值。方法用日本血吸虫尾蚴感染家兔,收集感染前及感染后不同时间的家兔血清。用酶联免疫方法检测家兔感染血吸虫后不同时间的血清中抗GST-HD融合蛋白及可溶性虫卵抗原(SEA)抗体IgG水平,观察不同感染时间点家兔对GST-HD、SEA的反应状况。用GST-HD检测90份急性血吸虫病人血清及30份健康人血清,评估其对血吸虫急性感染诊断的价值。结果在感染后的第17、21、24天,抗GST-HD的阳性率分别是42.85%、92.80%和100.00%,而抗SEA的阳性率分别为14.28%、50.00%和84.60%,GST-HD融合蛋白检测血吸虫早期感染的敏感性明显高于SEA。GST-HD融合蛋白检测急性血吸虫病人的阳性预告值及阴性预告值分别为98.89%和96.67%,诊断效率为98.33%。结论日本血吸虫23kDa膜蛋白分子的大亲水肽段融合蛋白具较好的血吸虫病早期诊断潜能。     

日本血吸虫虫卵排泄分泌物中具有诊断价值的抗原分子的初步鉴定

目的鉴定日本血吸虫虫卵分泌排泄物(ESA)中有血吸虫病诊断价值蛋白分子,为建立新的高敏感性和特异性的日本血吸虫病诊断方法奠定基础。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔后42d,解剖家兔,取肝脏,匀浆后收集虫卵,置于PBS中,4℃过夜,收集上清,制备虫卵排泄分泌物。以虫卵排泄分泌物包被酶标板,采用ELISA检测不同感染度、不同感染时间小鼠血清抗体滴度。同时以虫卵ESA ELISA分别检测血吸虫病患者血清、健康人血清和弓形虫病患者血清,观察虫卵ESA用于血吸虫病诊断的敏感性和特异性及交叉反应性。通过一维电泳免疫印迹、二维电泳免疫印迹和飞行质谱分析,鉴定虫卵ESA中具有诊断潜能的蛋白分子。结果 ELISA检测结果显示血吸虫感染小鼠血清中抗虫卵ESA抗体IgG水平随着感染时间的延长而升高,且与血吸虫感染度呈正相关,在感染早期即检出相应抗体。虫卵ESA检测血吸虫病患者血清的敏感性为97.2%,检测健康人血清的特异性为95.2%,与弓形虫病患者血清的交叉反应性为25.0%。一维电泳免疫印迹试验显示血吸虫感染兔血清可识别170×10~3、150×10~3、130×10~3、100×10~3、72×10~3、70×10~3、30×10~3 ku左右的ESA蛋白;二维电泳免疫印迹试验显示血吸虫感染兔血清可识别8个蛋白斑点,质谱分析其中1个蛋白斑点为日本血吸虫主要的虫卵蛋白P40。结论日本血吸虫虫卵排泄分泌抗原具有一定的血吸虫病诊断与早期诊断价值,虫卵的主要蛋白P40可能是一个具有诊断潜能的抗原分子。     

混合重组抗原用于血吸虫病诊断的研究

目的观察混合重组抗原用于血吸虫病诊断的价值。方法采用亲和层析法制备纯化的日本血吸虫23kDa膜蛋白分子大亲水肽段(SjC23HD)、21.7kDa膜蛋白(SjC21.7)和日本血吸虫虫卵毛蚴抗原(SjCMP10),采用酶联免疫吸附法对不同包被量的可溶性虫卵抗原、单个重组抗原、多个混合重组抗原检测血吸虫病血清抗体效果进行了比较。结果分别使用2.5μg/ml和7.5μg/ml的可溶性虫卵抗原包被酶标板,检测同一组血吸虫病人血清抗体的效果相同,但使用相同包被量的单一重组蛋白抗原及混合重组蛋白抗原检测同一组血吸虫病人血清抗体,混合重组蛋白抗原检测血清抗体的吸光度明显高于单一重组蛋白抗原,两者差异有显著性。用可溶性虫卵抗原与混合重组抗原同时检测39份急性血吸虫病人血清、80份慢性病人血清、27份晚期病人血清,两者阳性检出率相似。混合重组抗原检测20份华支睾吸虫病人血清及40份健康人血清无交叉反应和假阳性反应,特异性比可溶性重组抗原高。结论建立混合重组抗原诊断血吸虫病的方法,有助于提高重组抗原用于血吸虫病诊断的效能。     

用抗日本血吸虫虫卵单克隆抗体NP28-5B检测循环抗原的研究

本研究使用杂交瘤技术制备鼠抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)单克隆抗体NP28-5B,其同型鉴定为IgGl,针对的靶抗原分子量为140kD。将酶标记单抗NP28-5B进行Dot-ELISA直接法检测急性患者血清100份和慢性血吸虫病患者血清200份中循环抗原,阳性率分别为96％和98％,检测正常人血清200份,仅3例假阳性(1.5％)。用双盲法检测血吸虫病流行区江西矶山岛居民血清339份,其中粪检阳性血清114份,阳性率为89.47％,粪检阴性血清225份,阳性率为69.33％,研究证明NP28-5B具有高度诊断潜能。     

重组日本血吸虫极低密度脂结合蛋白的抗原性及诊断价值的研究

目的 探讨重组日本血吸虫特异性极低密度脂结合蛋白(SVLBP)的抗原性及其诊断价值。方法 SVLBP基因亚克隆入pQE-30表达载体，克隆菌在IPTG诱导下表达重组蛋白；非变性条件下制备克隆菌裂解液，用亲和层析法纯化重组蛋白；用Western blot鉴定其抗原性；纯化SVLBP重组蛋白免疫家兔获得抗血清；以SVLBP重组蛋白为抗原。ELISA法检测血吸虫感染者血清及健康人血清。结果 克隆菌在IPTG诱导下高表达SVLBP重组蛋白；该重组蛋白诱导家兔产生单特异抗体，抗体滴度为1：6400；SVLBP重组蛋白与血吸虫病人血清有较强的反应；以该蛋白为抗原检测36人份血吸虫感染者血清，阳性率为83．3％，50人份健康人血清，假阳性率为2％(1／50)，10人份肺吸虫病人血清，1例阳性。交叉反应率为10％(1／10)。结论 SVLBP重组蛋白有较好的抗原性，以该重组蛋白为抗原检测日本血吸虫病患者血清中特异性抗体。敏感性和特异性均较高。具有一定的诊断价值。     

快速诊断家畜日本血吸虫病免疫层析试纸条的研制与初步应用

目的开发研制敏感、简便、快速、经济的日本血吸虫病诊断试纸条。方法利用双抗原夹心法,以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)为检测抗原,以胶体金标记SEA为探针,采用自行设计的免疫层析试纸条装置,检测家畜血清中血吸虫特异性IgG抗体,并用ELISA方法进行比较。结果用该试纸条检测107份人工感染血吸虫病羊血清,其检出率为91.6%;检测80份健康绵羊血清,阴性符合率为87.5%;检测20份粪检阳性水牛血清及15份粪检阴性血清,其阳性符合率为100.0%,阴性符合率为86.7%;检测24份肝片形吸虫病羊血清,交叉反应率为12.5%,与锥虫病牛血清未见交叉反应;与ELISA检测结果比较,两种方法具有良好的一致性。结论应用试纸条诊断家畜日本血吸虫病敏感性高、特异性强,且操作简便、快速,不需特殊仪器设备,适合于基层使用。     

血吸虫病快速免疫诊断—胶体染料免疫渗滤法的初步研究

目的开发一种适合现场应用的血吸虫病快速免疫诊断方法。方法将纯化的日本血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)点于硝酸纤维素膜上,以捕获血清标本中血吸虫特异性抗体,通过胶体染料R3标记的SEA来直接显色,阳性者出现红色斑点。结果胶体染料免疫渗滤法检测急性血吸虫病人血清35份、慢性血吸虫病人血清107份、晚期血吸虫病人血清35份,其敏感性分别为100％、97.2％和74.3％。检测健康人血清87份,特异性为100％。检测肝吸虫病人血清38份、姜片虫病人血清11份、钩虫病人血清20份,其交叉反应率分别为2.6％、0.0％和0.0％,整过试验过程仅需2～3分钟,操作简单。染料标记SEA在室温条件下保存6个月、37℃恒温中保存62天,其活性均未发生明显变化。结论胶体染料免疫渗滤法检测各期血吸虫病结果准确,操作简便、快速、廉价、肉眼观察结果不需特殊仪器,特别适用于基层现场查病。     

抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原IgY的制备及初步应用

目的 目的 制备抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原 （Soluble egg antigen, SEA） 鸡卵黄免疫球蛋白 （Egg yolk immunoglobu? lin, IgY）, 探讨其应用于血吸虫病流行区查病的可行性。 方法 方法 在血吸虫病流行区采集间接红细胞凝集试验 （IHA） 阳性 者尿液, 在非流行区采集健康人尿液。以SEA经皮下注射免疫莱杭母鸡获得anti?SEA IgY, 以十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰 胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 测定其相对分子量; 并以anti?SEA IgY作为捕捉抗体, 采用双抗体夹心法ELISA检测IHA阳性者 和健康人尿液中的血吸虫循环可溶性虫卵抗原 （Circulating soluble egg antigen, CSEA）。 结果 结果 成功制备并纯化anti? SEA IgY。共检测IHA阳性者尿液48份, 在尿液中检出CSEA阳性26例, 检出率为54.17%; 检测健康人尿液10份, 均为阴 性。 结论 结论 基于IgY的免疫诊断技术可有效检出人尿液中CSEA, 其作为一种便捷、 无创伤的新方法可应用于血吸虫病 查病工作中。     

基于2-DE和蛋白质组技术筛选的日本血吸虫鸟氨酸氨基转移酶的表达及其诊断应用

目的扩增并表达日本血吸虫鸟氨酸氨基转移酶（SjOAT）,评价其在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法构建pET28a／sjOAT质粒,转化至E．coli BL21,IPTG诱导表达;应用Ni^2＋亲和层析法纯化OAT;SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定表达产物;应用ELISA法检测待检患者血清,比较SjOAT与日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）对血吸虫和其它寄生虫感染的检测结果。结果成功克隆表达了SjOAT,Western blot检测结果表明rSjOAT能被血吸虫病患者血清识别;以rSjOAT—ELISA和町SEA—ELISA分别检测急／慢性血吸虫病患者和其它寄生虫感染者血清的结果经校正χ^2检验,差异无统计学意义（P〉0．05）;对于正常对照者血清和疫区粪检阴性者血清,两种检测方法的特异性比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论rSjOAT在体外获得表达,用于诊断人血吸虫病具有高度敏感性和特异性。     

应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。     

IHA和DIGFA诊断血吸虫病可靠性分析

目的分析间接红细胞凝集试验(IHA)和金标免疫法(DIGFA)诊断血吸虫病的可靠性。方法采集经粪便孵化法确诊且未经治疗的血吸虫病患者血清标本46份和健康人血清42份,分别用IHA和DIGFA进行检测,观察2种方法的敏感度和特异度。IHA法每份血清做1∶5、1∶10、1∶20、1∶40共4个滴度。结果46份血吸虫病患者血清检测结果:IHA法1∶5、1∶10、1∶20、1∶40滴度检出率分别为91.30%(42/46)、76.09%(35/46)、65.22%(30/46)、45.65%(21/46),DIGFA法检出率为69.57%(32/46);42份健康人血清检测结果:IHA法1∶5、1∶10、1∶20、1∶40滴度阳性率分别为7.14%(3/42)、4.76%(2/42)、0%(0/42)、0%(0/42),IHA(1∶5)和IHA(1∶10)特异度分别为92.85%、95.24%,DIGFA的特异度为97.62%(41/42)。结论IHA和DIGFA检测血吸虫病患者血清阳性率(敏感度)偏低;用IHA和DIGFA诊断血吸虫病可信度较差;IHA的阳性阈值滴度为1∶5阳性检出率较高。     

日本血吸虫不同抗原检测家兔感染及治疗前后IgG/IgM抗体动态

目的探索特异性抗体检测在日本血吸虫病诊断和疗效考核中的潜在应用价值。方法ELISA方法采用可溶性虫卵抗原(SEA)、成虫抗原(AWA)检测人工感染家兔治疗前后血清中特异性IgGI、gM抗体,评价特异性抗体检测的诊断和疗效考核价值。结果用SEA抗原检测IgM抗体,发现感染后7周不管治疗与否,抗体水平均快速下降。与SEA相比,感染后AWA特异性IgM抗体上升时间早,且治疗后5个月仍为阳性。SEA特异性IgG抗体水平最高,但治疗后5个月仍为阳性。结论采用SEA抗原检测IgG用于血吸虫病诊断效果较好;对早期感染的诊断可以考虑SEA抗原检测IgM抗体作辅助。AWA抗原检测IgM,对急、慢性血吸虫感染均有较好诊断效果。采用这两种抗原检测IgG和IgM,均无考核疗效意义。     

微量血清血吸虫抗体检测层析卡的研制与评价

目的 研制血清用量少的血吸虫抗体检测层析卡。方法 采用Sephacryl S?300HR柱层析分离血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）,保留具有特异性反应活性的抗原蛋白组分。并研究标记浓度及稀释剂配方、样品缓冲液成分,组成最佳反应体系,建立血清用量5 μl的血吸虫抗体检测层析卡。结果 血吸虫抗体检测层析卡对血吸虫虫卵阳性病人的敏感性为93.7%,EPG <24的低感染度检出率达91.3%,健康人群的特异性为97.1%,并殖吸虫病人的交叉反应率为5.6 %,Youden指数为0.91。与ELISA平行检测流动人口的总符合率为96.1％,Kappa值为0.81。结论 血吸虫抗体检测层析卡具有血清用量少、敏感性高、特异性强、 交叉反应低、应用范围广等特点,具有现场实用价值。     

日本血吸虫重组膜外蛋白rSj29免疫诊断的初步应用

目的用重组日本血吸虫相对分子质量(Mr)29000膜外蛋白(rSj29)作为诊断抗原,探讨其在血吸虫病流行区免疫诊断的价值。方法在血吸虫病低度流行区芜湖南陵县弋江镇蒲桥和竞河村现场采血394份,同时采集粪样,用改良加藤法(三送九检)或集卵孵化法检查。制备rSj29和成虫粗抗原(AWA),分别用2种抗原进行间接ELISA(单盲法)和间接红细胞凝集试验(IHA)检测血样。结果粪检、IHA、rSj29-ELISA和AWA-ELISA检测结果显示,阳性率分别为4.8%(19/394)、62.2%(245/394)、68.3%(269/394)和89.9%(354/394)。rSj29-ELISA和IHA检测结果差异无统计学意义(χ2=3.2,P0.05),一致率为80.7%(318/394)。IHA、rSj29-ELISA和AWA-ELISA与粪检符合率分别为42.6%(168/394)、36.0%(142/394)和15.0%(59/394)。结论 rSj29间接ELISA法对日本血吸虫病有一定诊断价值。     

血吸虫病不同流行程度流行区IHA法阳性诊断阈值的研究

目的 探讨日本血吸虫病不同流行程度流行区IHA法的阳性诊断阈值。方法 选择江西省鄱阳湖区湖沼型血吸虫病流行区2个县（余干和星子）共55个自然村作为研究现场,对5岁以上常住居民采用病原学方法（Kato?Katz法+尼龙绢集卵孵化法）和血清学方法（IHA法）进行平行检测;检测结果采用相关分析和ROC曲线等方法分析,计算不同流行程度流行区IHA抗体水平阳性临界值。结果 血吸虫病流行区人群粪检阳性率与人群IHA血吸虫病特异性抗体水平分布趋势一致（r = 0.588, P ＜ 0.05）,与IHA阳性人群抗体水平无相关性（r = 0.221,P ＞ 0.05）;流行区2008-2011年连续4年血吸虫粪检阴性人群的IHA阳性抗体水平呈逐年下降趋势,年间差异有统计学意义（F = 3.650,P ＜ 0.05）,2008-2011年中任意1年血吸虫粪检阳性人群的IHA阳性抗体水平在4年内均维持较高水平且年间差异无统计学意义（F = 2.461,P ＞ 0.05）。流行村人群粪检阳性率< 1%、1%～5%和> 5%时,对应IHA的阳性诊断阈值分别为1∶80、1∶20和1∶10时,可提高IHA检测结果的特异性。结论 不同程度流行区采用IHA筛查血吸虫病或选择化疗对象时,可考虑选择不同的IHA阳性诊断阈值。     

日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）早期诊断效果的初步评估

目的  初步评估日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）的早期诊断效果。 方法  建立日本血吸虫感染家兔模型,日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）及基于该试剂盒所使用的血吸虫天然蛋白抗原X的ELISA法 (抗原X-ELISA法) 检测感染前及感染后第1、2、3、4、5、6周兔血清,并比较两种方法的早期诊断效果。 结果  日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）检测感染前及感染后第1、2周兔血清的阳性率均为0,从感染后第3w开始阳性率均达到100%;抗原X-ELISA法检测日本血吸虫感染前正常兔血清的假阳性率为30.77%,检测感染后第1、2周兔血清的阳性率分别为0和16.67%,从感染第3周开始阳性率也达到100%。两种方法检测同一时间点兔血清的阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论  日本血吸虫抗体检测试剂盒（IHA法）在早期诊断日本血吸虫病方面具有一定的潜在价值。     

组分抗原斑点金标免疫渗滤法检测血吸虫短程抗体的研究

目的建立一种可用于检测血吸虫病人短程抗体的斑点金标免疫渗滤法（dot immuno-gold filtration assay,DIG-FA）。方法将血吸虫可溶性虫卵组分抗原（107～121 kDa）包被于混纤膜上,以胶体金标记的抗人IgG为二抗,建立组分抗原-DIGFA。用该法检测慢性血吸虫病人、健康人、卫氏并殖吸虫病人和华支睾吸虫病人血清。同时与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）-DIGFA比较。结果检测54份慢性血吸虫病人血清,组分抗原-DIGFA敏感性为94.4%,SEA-DIGFA敏感性为96.3%,两种方法检测50份正常人血清的特异性均为100%。检测19份卫氏并殖吸虫病人血清和30份华支睾吸虫病人血清,SEA-DIGFA敏感性分别为26.3%和10.0%,组分抗原-DIGFA均未检出阳性反应。结论应用组分抗原-DIGFA检测血吸虫短程抗体具有较高的敏感性和特异性,且与其他吸虫病几乎无交叉反应,特异性优于SEA-DIGFA。