在不同细胞系中共聚物对超声介导基因转染的影响

目的 探讨超声和共聚物在不同细胞系中对基因转染的协同作用.方法 应用三种水溶性不同的共聚物F127,L61和P85;超声频率为1 MHz,脉冲重复频率100 Hz,占空系数为20%,用1 w/cm2声强照射20 s.选用C2C12,3T3-MDEI,CHO和H2K四种细胞系为研究对象.质粒DNA为可产生绿色荧光蛋白的GFP.应用荧光显微镜和流式细胞仪评价转染率,台盼蓝染色评价细胞的成活率.结果 超声可介导所有四种细胞系的基因转染.在C2C12,3T3-MDEI和CHO细胞系,共聚物可显著促进超声介导的基因转染效率(P＜0.01),对H2K细胞系共聚物不但不能促进超声介导的基因转染、,其中疏水性共聚物P85和L61反而使超声介导的基因转染效率降低(P＜0.05).结论 共聚物对不同细胞系超声介导的基因转染效率产生不同的影响,这种差异可能与细胞膜蛋白缺陷有关.     

超声和微泡造影剂介导细胞基因转染的实验研究

目的 探讨低频超声对细胞基因转染的作用。方法 超声治疗仪频率1MHz，脉冲重复频率100Hz，占空系数20％。质粒DNA为含编码绿荧光蛋白的pEGFP。应用荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞基因转染率，台盼蓝染色计算细胞成活率。选用C2C12、3T3-MDEI和CHO3种细胞系为研究对象，加入DNA后辐照不同声强、时间或加入超声造影剂，观察各条件下的细胞基因转染率和成活率。结果 ①超声介导的基因转染与声强和辐射时间有关，最佳剂量为1w／cm^2 20s；②同样超声剂量，较高的声强较早达到最大基因转染率；③较低剂量时，微泡造影剂可使超声介导的基因转染提高2～3倍并可显著提高最高基因转染率。结论 低频超声可介导细胞基因转染，基因转染率不但与超声辐射剂量有关，而且同样剂量时，高声强较早达到最大基因转染率，最佳剂量是1w／cm^2 20s。同时，微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率。     

超声和共聚物P85介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨超声和共聚物Pluronic P85能否介导HepG2细胞基因转染,并摸索超声辐照条件.方法 质粒DNA用EGFP,超声辐照加或未加P85的HepG2细胞,48 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量分析转染率,锥虫蓝染色评价细胞活性.结果 0.8 W/cm2、30 s时达到较理想的转染效率.超声 P85组转染率为单独超声组的3倍左右,超声 P85组细胞成活率80%左右,单独超声组细胞成活率60%左右.结论 超声和共聚物能介导HepG2细胞基因转染,在0.8 W/cm2、30 s时达较理想的转染效率,P85使超声介导的细胞损伤有一定程度的增加.     

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的 对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数.方法 选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 3种细胞系为研究对象,用1 MHz超声仪.超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光索酶质粒(pCMV-LUC)的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用.结果 基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30 μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同.与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P＜0.01).辐照3 min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间.无超声辐照时,单独应用质粒或微泡十质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白.与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P＜0.01).结论 UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染.     

超声联合脂氟显微泡转染HepG2细胞的参数优化

目的 探索治疗性超声联合脂氟显微泡对人肝癌细胞HepG2基因转染的可行性及其实现高效率转染的优化参数.方法 HepG2细胞交叉间隔接种于24孔板,用治疗性超声辐照含脂氟显微泡和EGFP质粒的各组细胞.分组:超声强度梯度组(A组),A1～A5亚组,分别为0.4 W/cm2、0.8 W/cm2、1.2 W/cm2、1.6 W/cm2和2.0 W/cm2;占空比梯度组(B组),B1～B3亚组,分别为10％、20％和50％;时间组(C组),C1～C3亚组,分别为30 s、90s、180 s.24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞死亡率.结果 不同超声强度、占空比和时间下,质粒转染效率各不相同.在一定范围内,分别增加超声强度、占空比和时间均可以提高转染效率.对于超声强度和占空比,当设置过高(声强＞1.6 W/cm2或占空比＞50％)时,由于细胞死亡率增加导致实际转染效率下降.超声强度为1.2 W/cm2时,转染率和死亡率优于A组其余各亚组;占空比为20％时,转染率和死亡率优于B组其余各亚组.当超过90s后继续增加时间,对于转染率和细胞死亡率的影响无明显统计学意义(P＞0.05).结论 超声辐照微泡是一种介导基因体外转染的有效方法,不同参数下转染率差别较大,优化参数有利于促进基因转染.     

不同浓度超声微泡结合共聚物P85对人肝癌细胞HepG2基因转染的影响

目的 不同浓度超声微泡造影剂(MB)结合共聚物P85后联合一定强度超声(US)辐照,初步摸索最适人肝癌细胞HepG2质粒转染及表达的MB浓度。 方法 以人肝癌细胞HepG2为研究对象,以绿色荧光蛋白(EGFP)质粒为报告基因,添加共聚物P85和不同浓度的MB后进行脉冲多普勒US辐照。24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率。 结果 MB浓度在30%时达到较理想的转染率(22.14±3.06)%,且细胞存活率无明显下降(55.73±3.32)%。添加MB后基因转染率均较pEGFP+P85+US转染率高。 结论 MB与共聚物P85结合同时给予US辐照可增强基因转染率,且在MB浓度为30%时达到较理想的转染率。     

超声辐照联合PEI介导基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合聚乙烯亚胺(PEI)在促进肝癌细胞(HepG2)的基因转染中有无协同作用.方法 选用工业用和实验用PEI为研究对象.用锥虫蓝拒染法检测细胞成活率,选取合适的PEI浓度与绿色荧光蛋白基因(EGFP)质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA)导入HepG2细胞中和/或辐照超声.24 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪定量分析转染率.结果 超声可促进质粒DNA在HepG2细胞的基因转染.PEI对细胞有毒性,当PEI浓度为0.001%时细胞成活率约为70%,选此浓度用于基因转染实验.2种PEI复合物均能显著促进质粒DNA基因转染,其转染率高于单纯辐照超声介导的基因转染,差异有统计学意义(P＜0.01),2种PEI的转染率工业用组(15.42士4.71)%、实验用组(12.27±3.58)%之间的差异无统计学意义(P＞0.05),加入PEI联合辐照超声后转染率下降(P＜0.01).结论PEI和超声均能促进HepG2细胞基因转染,但PEI联合辐照超声后转染率明显下降,二者没有协同作用.工业用与实验用PEI一样具有促进基因转染的作用.     

超声介导SonoVue微泡破裂对hAng-1基因完整性和表达效率的影响

目的 探讨超声联合SonoVue微泡介导hAng-1基因转染293T细胞的转染效率及基因完整性和表达状况.方法 构建eGFP-C3-hAn-1质粒,根据不同实验组的设计,应用相应的微泡联合超声辐照条件进行293T细胞的eGFP-C3-hAng-1基因转染,转染后48 h,以荧光显微镜观察到绿色荧光为转染成功标志;流式细胞术检测基因转染阳性细胞率,台盼蓝染色检测细胞生存率;RT-PCR和Western blot技术检测hAng-1基因的mRNA和蛋白表达;琼脂糖凝胶电泳检测经超声辐射后质粒的完整性.结果 ①微泡浓度为20%,DNA浓度为15 mg/L时进行基因转染可获较好转染效率和细胞生存率;②转染体系中血清的存在并不影响转染效率和细胞生存率;③最适转染条件下的超声辐照剂量不会影响DNA的完整性,且转染后的基因可正常表达mRNA并翻译目的蛋白.结论 微泡联合超声辐照能够介导体外细胞治疗性基因的转染,血清的存在并不影响基因的转染,转染后的基因能顺利地表达并具有正常功能.     

超声辐照和SonoVue微泡在介导hAng-1基因体外转染时的作用和量效关系探讨

目的 探讨超声辐照和SonoVue微泡分别使用和联用在介导hAng-1基因体外转染过程中的作用以及辐照强度和微泡浓度对转染效率和细胞活性的影响.方法 实验分四组A组:单纯超声辐照+质粒组;B组:微泡+质粒组;C组:超声辐照+微泡+质粒组和空白对照组D组. C组内转染参数分别设置为超声照射强度0.5、1.0 、1.5和2.0 W/cm~2,微泡浓度5%、10%、20%、30%和40%.将连接有eGFP-C_3-hAng-1质粒的SonoVue微泡对293T细胞进行转染,48 h后检测各组基因转染效率和细胞存活率. 结果转染48 h后C组转染效率最高,荧光阳性细胞数最多,强度最大;A组转染效率很低,见少量荧光表达;B、D组无明显基因转染发生.随着超声照射强度和微泡浓度的增加,基因转染效率会逐步升高,具有统计学意义.微泡浓度大于20%、超声照射强度超过1.5 W/cm~2后基因转染效率不再升高甚至降低,细胞死亡率显著增高(P<0.01).结论 SonoVue微泡介导外源基因转染必须联合超声辐照才能获得较好的转染效率.对于hAng-1基因和SonoVue微泡,选择声强1.5 W/cm~2,微泡浓度20%是相对最佳转染条件.     

不同声学微泡对超声介导体外基因转染的作用

目的探讨超声介导基因转染时,不同声学微泡[脂质体微泡(LM)和SonoVue微泡]对体外基因转染的作用及其安全性。方法将红色荧光蛋白基因(DsRed)和LM加入培养的Hela细胞,后行超声辐照(US),对其他4种不同类型的细胞系(HepG_2、Ishikawa、MCF-7和B16-F10)行超声处理,并与PEI介导的基因转染进行比较分析,运用荧光显微镜、流式细胞术评估基因转染率和细胞损伤。结果培养的细胞经LM和超声辐照联合处理后(P+UTMI)),HepG_2、MCF-7的基因转染率略优于Sono Vue微泡转染时(P0.01),且未发现显著的细胞损伤;不同细胞类型对超声的反应性不同。与非辐照组相比,转染率和死亡率均有不同程度的增加。结论声学微泡对超声介导的体外基月转染有显著的增效作用,为基因治疗提供一种新颖、高效、安全的非病毒基因转染方法。