细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig与移植器官免疫耐受的研究进展

器官移植在 2 1世纪进入了一个蓬勃发展的新时期。然而 ,移植引起的排斥反应仍然是影响移植最终成功的最大障碍。尽管在过去 2 0年里出现了许多免疫抑制剂 ,然而移植排斥问题尚未得到完全解决。这些免疫抑制剂是非特异性的 ,在控制移植物排斥的同时 ,要面临发生致死性感染和肿瘤的危险。控制移植物排斥最理想的方法是特异性抑制 ,只涉及移植排斥的淋巴细胞而不影响其它淋巴细胞的功能。因此 ,诱导对移植物的耐受是解决排斥的最理想方法。对于细胞毒性Ｔ淋巴细胞相关抗原 4 (ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ…     

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4诱导新鲜异体骨移植免疫耐受的实验研究

目的　利用外源性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 ( cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4immuno globlin,CTL A4 - Ig)阻断T细胞反应的第2信号,诱导新鲜同种异体骨移植免疫耐受。　方法　采用近交系小鼠BAL B/C 6 6只作为骨移植的受体,进行异位肌袋一次及第2次骨移植。一次移植分为3组,每组18只,一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射L6 (对照品) ,为AL组;一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射CTL A4 - Ig,为AC组;一组移植同系BAL B/C小鼠骨骼,注射PBS缓冲液,为AB组。在第2、4及6周,进行血淋巴细胞亚群分析,血清抗体测定,供体细胞及抗原二次刺激实验及组织学观察。另取12只BAL B/C小鼠,进行第2次移植实验,供体为C5 7BL/6小鼠的骨骼,注射CTL A4 - Ig后2周,分别移植C5 7BL/6 ( BC组)和C3H( BH组)小鼠的骨骼,检测产生免疫耐受的特异性。　结果　AL组与AB组比较,产生了强烈的免疫排斥反应,移植后2、4及6周,CD4 T细胞的增殖明显增加( P<0 .0 5 ) ,血清抗体明显增多( P<0 .0 5 ) ,供体细胞及骨抗原二次刺激的细胞增殖也明显增加( P<0 .0 5 ) ;AC组免疫排斥反应较轻,在CD4 T细胞的增殖、血清抗体及二次刺激的细胞增殖方面均与AB组相似( P>0 .0 5 ) ;组织学观察也显示,异体骨周围的淋巴细胞浸润消失,软骨诱导及新骨形     

重组腺病毒载体局部介导CTLA4Ig延长小鼠异体移植皮肤的存活

目的 寻求一种简单可行的延长异体移植皮肤存活的方法。方法 将CTLA4Ig cDNA插入重组腺病毒载体柯氏质粒中,再通过同源重组构建CTLA如一重组腺病毒载体;观察该表达载体对体外培养的皮肤组织块的转染情况;并应用该载体转染皮肤移植物及局部创面,观察其对昆明小鼠→Balb c小鼠背部创面异体移植皮肤存活期的影响。结果 CTLA4Ig重组腺病毒载体能成功转染并表达于体外培养的皮肤组织块中;局部应用CTLA4Ig重组腺病毒载体使小鼠异体移植皮肤存活期延长至21d。结论用腺病毒载体局部转染CTLA4Ig能有效延长异体移植皮肤的存活。     

结肠癌易感性与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4的关系

目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因外显子49位点及启动子1661位点单核苷酸多态性(SNP)及临床病理参数与青岛地区人群结肠癌的发病的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)检测来自青岛地区人群结肠癌患者及对照组中位CT-LA-4+49A/G,-1661A/G基因多态性的分布,并研究多态性与结肠癌临床病理参数的关系。结果:1)CT-LA-4+49A/G:与AA基因型携带者相比,AG及GG基因型人群罹患结肠癌的风险都显著增加(P=0.00),携带GG基因型罹患结肠癌的风险明显增加5.12倍,且男性、吸烟结肠癌患者携带AG及GG基因型明显增加;2)CTLA-4-1661A/G:以AA基因型为对照,AG+GG基因型携带者的患病风险显著增高,为对照组的2.50倍(P=0.001),多态性与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤分化程度及TNM分期无相关性。结论:CTAL-4+49A/G及-1661A/G基因多态性与结肠癌的遗传易感性相关,性别、吸烟与否也是影响因素。     

转染细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白基因的同供体大鼠树突状细胞对胰岛移植物存活的影响

目的　探讨转染细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(转染CTLA4Ig基因)的同供体大鼠DC细胞对同种大鼠胰岛移植的影响。方法　链尿菌素(STZ) 60mg/kg体重腹腔内注射制作SD大鼠糖尿病模型,胶原酶法分离、Ficoll 40 0密度梯度离心法纯化胰岛,GM CSF +IL 4诱生培育的方法,获得高纯度的DC ,含目的基因CTLA4Ig重组腺病毒AdvCTLA4Ig ,转染同供体DC细胞,与胰岛细胞同时移植于糖尿病受体大鼠肾包膜下,免疫组织化学、Dot ELISA、逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测CTLA4Ig基因在实验组和对照组DC细胞中的表达,并检测受体大鼠的血糖浓度变化,同时观察受体存活情况。结果　实验组DC细胞有CTLA4Ig表达,而对照组DC细胞没有CTLA4Ig表达,实验组正常血糖维持时间(17.3±2 .4)d较对照组(10 .1±1.5 )d、空白对照组(8.3±1.2 )d显著延长,实验组、对照组和空白对照组受体大鼠存活天数分别为(3 4.5±3 .4)d、(14 .7±2 .3 )d和(11.2±1.4)d ,实验组高于对照组(P <0 .0 1)。结论　表达CTLA4Ig基因的DC细胞可能诱异胰岛移植免疫耐受,延长胰岛移植物的存活时间     

食管癌易感性与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因多态性的关系

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)基因3个位点基因型及单倍型频率分布与食管癌易感性的关系.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测205例食管癌患者(男113例,女92例)和205例与病例组同性别、同年龄的正常对照者CTLA4基因第一外显子区+49A/G、启动子区-1661A/G和-1772A/G位点的基因型,采用条件Logistic回归模型分别进行基因多态性、单倍型与食管癌易感性的相关分析.结果 CTLA4+49位点基因型AG和AA均增加食管癌发病风险(P＜0.01,OR=2.280;P＜0.O1,OR=2.192).-1661位点AG基因型频率在病例组也高于对照组(P＜0.01,OR=1.848),而GG基因型在两组间分布差异无统计学意义(P＞0.05);-1772位点各基因型频率在病例组和对照组分布差异均无统计学意义(P＞0.05).单倍型分析显示AAG单倍型可增加食管癌的风险(P＜0.01,0R=5.035),而GAA单倍型则降低食管癌风险(P＜0.01,0R=0.413).结论 CTLA4基因+49A/G和-1661A/G位点基因多态性与食管癌易感性相关,单倍型分析进一步证实AAG单倍型为食管癌的危险因素,而GAA单倍型是其保护因素.     

BALB/C小鼠4T1乳腺癌细胞混合肽诱导特异性免疫应答的研究

本研究采用细胞冻融法获取BALB/C小鼠4T1乳腺癌细胞抗原肽,在体外构建热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）抗原肽复合物（HSP70-peptids complex,HSP70-PC）并观察该复合物对BABL/C小鼠脾细胞的激活与增殖作用及增殖后脾细胞对4T1细胞的杀伤作用;并进行体内实验观察HSP70-PC对BALB/C小鼠的免疫保护作用.目的在于为乳腺癌的免疫治疗探索一条新途径.     

胃癌易感性与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4基因+49A/G多态性的关系

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)基因外显子1区+49A/G位点多态性在中国人群中的分布及其与胃癌易感性的关系.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测205例胃癌患者和262例正常对照者CTLA-4基因+49A/G多态位点基因型频率,进行多态性与胃癌易感性的关系分析并进行分层分析.结果 CTLA-4基因外显子1区+49位点A/G、G/G基因型在胃癌组患者中的分布频率明显高于对照组(P＜0.01,OR=2.146;P＜0.01,OR=3.215);分层分析示:男性患者、年龄在40～55岁之间、不吸烟、不饮酒患者组等组别的胃痛患者携带G/G基因型的频率较正常对照组显著增加.结论 CTLA-4基因外显子1区+49A/G多态性与胃癌易感性有明显相关,携带A/G、G/G基因型的个体胃癌发病风险增加,分层因素也影响这一结果.     

CTLA4-Ig基因对大鼠肝移植后免疫细胞浸润及细胞凋亡的影响

目的研究腺病毒介导的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig(cytolyticT-lymphocyteassociatedantigen4-Ig,CTLA4-Ig)基因对大鼠肝移植后移植物中免疫细胞浸润和细胞凋亡的影响。方法将大鼠原位肝移植模型分为排斥对照组、环孢素A(CsA)组和CTLA4-Ig组。分别于术后1,3,5,7,12d,用免疫组织化学法和缺口末端标记技术(TUNEL法)分别测定移植物中CTLA4-Ig基因的表达和巨噬细胞、CD8 T细胞浸润及细胞凋亡,并以病理形态学变化作参照。结果静脉注射重组CTLA4-Ig基因腺病毒7d后,大鼠肝脏CTLA4-Ig稳定表达,在肝移植60d后仍呈阳性;CTLA4-Ig组汇管区巨噬细胞、CD8 T细胞浸润明显较排斥对照组少;细胞凋亡指数在术后3、5和7d明显低于排斥对照组(P<0·01),汇管区巨噬细胞、CD8 T细胞浸润数和凋亡指数与排斥反应分级均显著相关。结论重组CTLA4-Ig基因腺病毒经静脉一次给药后能在大鼠肝脏稳定表达,并通过抑制移植物中免疫细胞浸润及移植物细胞凋亡,抑制移植后急性排斥反应。     

重组腺病毒介导CD40L和CTLA4Ig的共表达和对人混合淋巴细胞反应的抑制作用

CD40／CD40L和B7／CD28是两条重要的共刺激通路，在T淋巴细胞活化过程中提供共刺激信号，在自身免疫性疾病和移植排斥反应的发生、发展过程中起重要作用，干预其相互作用，可有效地预防和治疗自身免疫性疾病和排斥反应。本研究基于我们构建的重组腺病毒CIMOL-IRES-CTLA4Ig，观察其体外的共表达情况和对人外周血混合淋巴细胞反应（MLR）的作用。     

CTLA4-Ig抗大鼠肝移植排斥反应及诱导免疫耐受的实验研究

目的 建立大鼠原位肝移植（ROLT）急性排斥反应模型．探讨细胞毒淋巴细胞抗原4免疫球蛋白（CTLA4-Ig）抗排斥反应和诱导免疫耐受的作用。方法采用“二袖套管”法建立Wistar→SD大鼠配对组合的肝移植后排斥反应模型．并于术后第2天腹腔内一次性注射CTLA4-Ig（75pg／只大鼠）．与未给药的相同组合的排斥反应模型鼠对照研究．观察移植术后7d2组动物的一般情况、肝功能变化、移植肝病理改变及血清TNF-α水平的变化，同时观察CTLA4-Ig组动物术后4个月时的上述情况．以了解CTLA4-Ig抗排斥及诱导免疫耐受的作用。结果①对照组动物于肝移植术后6～14d内相继死亡；移植肝出现明显的排斥反应的病理改变征象。②CTLA4-Ig组动物于术后7d及4个月均未见明显的排斥反应表现．移植肝无明显的排斥反应的病理改变征象．血清TNF-α、ALT、AST、TBIL及DBIL水平均明显低于对照组（P〈0．05）．TP及A1b水平则明显高于对照组（P〈0．05）。结论CTLA4-Ig有抗排斥反应及诱导免疫耐受功能的作用；血清TNF-α水平作为观察ROLT后排斥反应的指标，可能有一定的参考价值。     

负载异体抗原对低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子诱导的树突状细胞免疫学性状的影响

目的观察低剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱生的未成熟树突状细胞(GM~(low)DC)对异体抗原的摄取能力,以及负载异体抗原后细胞表型和功能的改变。方法对处于增殖期的C_(57)BL/6小鼠单个核细胞(MNC)作氚标记亮氨酸(~3H-Leu)掺入处理,制备~3H-Leu标记的抗原上清液。将此抗原上清液分别与昆明小鼠GM~(low)DC和成熟树突状细胞(DC)孵育30、60、90 min,检测细胞每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值；用流式细胞仪检测负载异体抗原前后GM~(low)DC表面I~A/I~E、CD80分子的表达情况。分离C_(57)BL/6小鼠的T淋巴细胞,根据加入的刺激因素分组并进行同种混合淋巴细胞反应(MLR)：对照组(不加刺激因素)、GM~(low)DC组、GM~(low)DC+异体抗原组、GM~(low)DC+异体抗原+细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Ig(CTLA-4Ig)组。检测各组细胞cpm值,计算刺激指数(SI)。结果加入异体抗原上清液后30、60、90 min,GM~(low)DC的cpm值均明显高于同时相点的成熟DC(P＜0．05或0．01)。负载异体抗原前,GM~(low)DC细胞表面I~A/I~E的表达率为(32±8)%,CD80的表达率为(25±10)%；负载后两者分别为(54±10)%、(71±18)%,均明显升高(P＜0．05或0．01)。MLR：GM~(low)DC+异体抗原组细胞cpm值明显高于对照组(P＜0．05),SI＞2．0；GM~(low)DC组以及GM~(low)DC+异体抗原+CTLA-4Ig组细胞cpm值与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0．05),AI均＜2．0。结论GM~(low)DC具有较强的抗原摄取能力,负载抗原后,细胞在表型及功能上渐趋成熟。应用CTLA-4Ig可阻断其免疫应答效应,建立免疫耐受。     

携带供者抗原的第三方树突状细胞诱导小鼠皮肤移植耐受的研究

目的 了解携带供者抗原的第三方树突状细胞(DC)是否具有与供者源未成熟DC相似的免疫功能.方法 雌性C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠和昆明小鼠分别为皮肤移植的供者、受者和第三方.将40只BALB/c小鼠分为对照组、环磷酰胺组、供者源未成熟DC组、第三方未成熟DC组、携带供者抗原第三方DC组,每组8只.后4组大鼠皮肤移植术前4 d用环磷酰胺(200 mg/kg)预处理,对照组同法给予等量等渗盐水.后3组术前2 d用1 ml相应DC悬液(1×107个/ml)预处理,并在术后12 d重复给予1 ml DC悬液(1×107个/ml)1次;前2组于上述2个时相点同法给予等量等渗盐水.记录各组皮片平均成活时间(MST)并于术后5 d对皮片进行组织学观察.结果 与对照组(16.1±3.5)d比较,供者源未成熟DC组和携带供者抗原第三方DC组小鼠移植皮片的MST明显延长,分别为(38.3±7.7)、(34.9±7.7)d(P＜0.01);携带供者抗原第三方DC组与供者源未成熟DC组皮片的MST相近(P＞0.05),但与第三方未成熟DC组(23.7±2.7)d比较,差异有统计学意义(P＜0.05).镜下见携带供者抗原第三方DC组移植皮片结构较清楚、排列有序,与供者源未成熟DC组情况相近.结论 携带供者抗原的第三方DC与供者源未成熟DC,均可在一定程度上建立抗原特异性免疫耐受.     

Effect of CTLA4-Ig on Obliterative Bronchiolitis in a Mouse Intrapulmonary Tracheal Transplantation Model

Objectives: One of the serious problems after lung transplantation is chronic lung allograft dysfunction (CLAD). Most CLAD patients pathologically characterized by obliterative bronchiolitis (OB). Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4)-Ig is a combination protein of the Fc fragment of human IgG1 linked to the extracellular domain of CTLA4. The aim of the study was to examine the effect of CTLA4-Ig therapy on OB using a mouse intrapulmonary tracheal transplantation (IPTT) model.Methods: IPTT was performed between BALB/c (donor) and C57BL/6 (recipient) mice. Abatacept, which is a commercially available form of CTLA4-Ig, was intraperitoneally injected in recipient mice immediately after surgery, on days 7, 14, and 21. The mice in the control group received human IgG.Results: We performed semi-quantitative analysis of graft luminal obliteration at post-transplant day 28. We calculated the obliteration ratio of the lumen of the transplanted trachea in each case. The obliteration ratio was significantly lower in the CTLA4-Ig group than that in the control group (91.2 ± 2.1% vs. 47.8 ± 7.9%, p = 0.0008). Immunofluorescent staining revealed significantly decreased lymphoid neogenesis in the lung.Conclusions: CTLA4-Ig therapy attenuated tracheal obliteration with fibrous tissue in the mouse IPTT model. The attenuation of fibrous obliteration was correlated with the inhibition of lymphoid neogenesis.     

CTLA4-Ig基因修饰骨髓间充质干细胞抑制大鼠肝移植排斥反应

目的  探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)在抑制大鼠原位肝移植排斥反应的作用及机制。方法  采用重组腺病毒(Ad)5-CTLA4-Ig转染MSC。转染72 h后,提取细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测转染后MSC中CTLA4-Ig的蛋白表达。采用细胞计数试剂盒(CCK)-8方法检测未转染和转染后的MSC对外周血淋巴细胞增殖的抑制作用。以雄性Lewis大鼠为供体(40只);以雄性Brown Norway(BN)大鼠为受体(40只)。采用改良的Kamada两袖套法进行原位肝移植,建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。40只受体大鼠随机分为4组,每组10只。其中对照组(A组),于肝移植时门静脉输注生理盐水;MSC治疗组(B组),于肝移植时门静脉输注MSC;转基因MSC治疗组(C组),于肝移植时门静脉输注转基因MSC;免疫抑制剂治疗组(D组),于肝移植时门静脉输注生理盐水,术后即给予环孢素(CsA)1.5 mg/(kg·d)肌内注射,连续8 d。每组大鼠取5只观察生存情况。每组其余5只于术后第9日处死,检测外周血细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-4、干扰素(IFN)-γ水平,光学显微镜下观察肝组织病理学变化和排斥反应程度。结果  重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后, 蛋白质印迹法可检测到转染后的MSC中有CTLA4-Ig的蛋白表达。当未转染的MSC:外周血单核细胞比例为1:10、1:20时,MSC抑制淋巴细胞增殖的作用分别为85.60%、76.69%。重组Ad5-CTLA4-Ig转染MSC 72 h后,在相同的数量比下,其抑制淋巴细胞增殖的作用分别为90.50%、84.20%;与未转染的MSC比较,转染后抑制淋巴细胞增殖的作用增强(P<0.05)。A、B、C、D组大鼠肝移植术后存活时间分别为(13±3),(41±6),(90±15),(102±18)d。A、B、C组的大鼠术后存活时间比较差异有统计学意义(P<0.05),C组和D组的大鼠术后存活时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,B组和C组的IL-4水平明显升高;与B组比较,C组的IL-4水平明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);C组和D组的IL-4水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,B组和C组的IL-2、IFN-γ水平明显降低,C组的IL-2、IFN-γ水平亦低于B组,差异均有统计学意义(均为P<0.05),C组和D组的IL-2、IFN-γ水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠肝组织病理检查结果显示,A组移植肝发生重度排斥反应,B组移植肝亦发生排斥反应,但与A组比较程度较轻。C组与D组移植肝有轻度排斥反应。结论  重组Ad-CTLA4-Ig转染MSC可抑制肝移植排斥反应,其效果优于MSC单独应用。     

自体脂肪颗粒及微粒皮混合移植修复烧伤患者深度创面

目的 了解自体脂肪颗粒及微粒皮混合移植修复大面积烧伤深度创面的效果. 方法选择20例重度烧伤患者,采用自身同体对照法,将患者双侧肢体或躯干对称部位创面分为脂肪颗粒+微粒皮组和微粒皮组,分别行自体脂肪颗粒+微粒皮(体积比1:1)混合移植和自体微粒皮移植.术后30、45、60 d计算2组创面愈合率;术后7、14、21、28 d取创面组织,行HE染色和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学观察. 结果移植术后30、45、60 d,脂肪颗粒+微粒皮组创面愈合率分别为(56.3±3.1)%、(76.4±6.1)%、(96.2±1.5)%,均明显高于微粒皮组的(28.3±2.0)%、(47.3±4.8)%、(85.4±2.2)%(P<0.01).HE染色显示脂肪颗粒+微粒皮组创面上皮化早于微粒皮组,胶原纤维排列较整齐.脂肪颗粒+微粒皮组PCNA阳性细胞较微粒皮组多,主要分布于表皮基底层. 结论自体脂肪颗粒+微粒皮混合移植可促进创面愈合.