不同发育阶段人胚胎原始生殖细胞的定位及体外培养

目的:对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞(PGC)进行定位并比较其体外培养的差异.方法:取4～7周发育阶段的人胚胎,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶(AP)以对其定位.体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养,第1次传代后,用AP标记,计数不同发育阶段AP阳性的PGC和体外培养的阳性克隆并进行比较.结果:在卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处有AP强阳性细胞,阳性信号位于胞质内.阳性细胞散在分布,在生殖嵴处聚集成团.不同发育阶段的胚胎组织培养均有阳性克隆出现.统计学分析结果表明,4～7周人胚胎内AP阳性的PGC数目及细胞内信号强度无明显差异(P>0.05);由胚胎组织培养获得的AP阳性克隆数也无显著差异.结论:人PGC位于卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处.4～7周发育阶段,胚胎内PGC数目和体外培养的克隆数无明显变化.     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

目的 探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件。方法 将ＥＳ－Ｄ３细胞株培养在ＳＮＬ饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下，培养基中加入小鼠白血病抑制因子或用Ｂｕｆｆａｌｏ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ（ＢＲＬ）条件培养Ａ在进行培养，并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色分析。结果 ＥＳ－Ｄ３在上述培养体系中能形成正常形态伯克隆，并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性，而且核型保持稳定。     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

【目的】探讨保持胚胎干细胞 (EScells)全能性的体外培养条件。【方法】将ES D3细胞株培养在SNL饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下 ,培养基中加入小鼠白血病抑制因子 (mLIF)或用BuffaloRatLiver(BRL)条件培养基进行培养 ,并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色体分析。【结果】ES D3在上述培养体系中能形成正常形态的克隆 ,并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性 ,而且核型保持稳定。【结论】说明上述各种培养体系均能保持ES D3的高度未分化状态及正常的二倍体核型。     

Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

目的:建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法.方法:用免疫溶解法(immunosurgery)分离3.5 d的129SvJ系小鼠囊胚内细胞团,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,胰酶消化传代.用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志,常规G带法行染色体核型分析,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力.结果:得到一个单细胞克隆129系小鼠胚胎干细胞系G11能长期稳定增殖不分化,具有正常40XY核型,碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性,在体和离体条件下可分化为多种细胞.结论:以小鼠为模型成功建立了哺乳动物胚胎干细胞的培养方法和培养系统.     

人原始生殖细胞分离培养的初步研究

[目的]探讨分离培养人原始生殖细胞的最佳条件。[方法]用胰蛋白酶消化5～9周人流组织中的人胚生殖嵴,获取人原始生殖细胞。以小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层,在高糖DMEM培养基中添加10μmol/L福司克林(forskolin)和5～μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养液中培养、传代,并对子代细胞进行碱性磷酸酶活性检测和体外分化实验。[结果]原代培养时形成许多大小不等,形态各异的由人原始生殖细胞组成的集落,约5～7d传代。传代后,集落生长,变大。细胞培养到第七代,检测碱性磷酸酶染色为强阳性,体外分化实验有拟胚体形成。[结论]人原始生殖细胞可以用胰蛋白酶消化分离培养。用高糖DMEM培养基,添加forskolin和bFGF有利于人原始生殖细胞增殖。体外分化实验初步证实人原始生殖细胞具有多向分化潜能。     

口腔黏膜上皮细胞体外培养的研究

目的 建立一种新的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。方法 结合组织块法和酶消化法，先用分离酶消化获取单纯的口腔黏膜上皮组织，再将组织块种植于培养皿，经原代培养和传代培养，光镜观察培养细胞。酶消化后组织块行既染色，观察分离酶作用部位。培养细胞行抗角蛋白抗体免疫组化染色。结果 分离酶作用于基底膜。可以完整地将上皮细胞与固有层分离，细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，抗角蛋白抗体染色阳性。结论 该培养方法可获取纯净的人口腔黏膜上皮细胞，建立符合临床研究所需要的口腔黏膜上皮细胞体外培养模型。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

大鼠胚胎上胚层干细胞的分离培养研究

目的 获取SD大鼠胚胎中附植后的胚胎上胚层干细胞(EpiSCs),并就影响SD大鼠EpiSCs(SDEpiSCs)分离与培养的组织来源、胎龄、细胞因子等条件进行探讨,从而探索适宜SD大鼠EpiSCs分离培养的实验体系,为下一步SD大鼠EpiSCs的建系提供实验研究基础.方法 以昆明小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,分别取5.5日胎龄的囊胚和7.5日胎龄囊胚上胚层(Epiblast),用添加白血病抑制因子(LIF)或活化素(activin)的基础培养基进行原代培养,分别采用机械法和胰酶消化法对克隆集落进行传代培养.最后通过碱性磷酸酶染色对克隆集落进行鉴定分析,并检测其体外分化能力.结果 培养于LIF培养基和activin培养基中的囊胚均发生严重分化.培养于LIF培养基中的Epiblast也发生了严重的自发分化,而在activin培养基中,Epiblast形成SDEpiSCs原代集落.经机械法传代获得AKP染色阴性、能形成拟胚体的SDEpiSCs.结论 利用细胞因子activin,结合机械传代法可从7.5日胎龄SD大鼠胚胎中获得SDEpiSCs.     

胎兔颅骨成骨细胞克隆筛选及鉴定

目的 筛选胎兔颅骨细胞原代培养中的细胞克隆,建立成骨细胞株。方法 从胎兔颅骨组织中分离培养颅肌细胞,有此基础上,运用有限稀释法行克隆传代筛选,建立成骨细胞株,并用酶组化、免疫组化及染色体染色等方法予以鉴定。结果 原代培养的颅骨细胞来源复杂,形态多样;克隆传代筛选的细胞株,细胞形态单一,碱性磷酸酶组化染色呈强阳性,骨形态发生蛋白免疫组化染色呈强阳性,钙红染色显示具有成骨能力;染色体数目形态保持相对稳     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体

目的:研究人类胚胎干细胞的体外多向分化能力.方法:胚胎干细胞在无饲养细胞、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、悬浮条件下培养形成类胚体.采用RT-PCR方法检测不同培养时间类胚体中某些功能细胞的特征分子标志.结果:在无饲养细胞、无bFGF、悬浮条件下培养,胚胎干细胞自动聚集形成细胞团,逐渐长大并分化为囊实性类胚体.RT-PCR显示,类胚体表达多种细胞前体及功能细胞的分子标志,如神经前体细胞、胰岛前体细胞以及成熟神经细胞、表达胰岛素的β细胞、表达胰高血糖素的α细胞和肝细胞等等.不同细胞标志在类胚体中出现的时间段有差异,先出现分化程度低的前体细胞分子标志,然后出现成熟细胞的分子标志.结论:人类胚胎干细胞体外可自然分化为表达多种细胞标志的类胚体,是进行深入体外诱导分化研究的基础.     

人胚胎干细胞系的初步建立

目的：探讨人受精卵建立人胚胎干细胞系。方法：将体外受精获得的人受精卵发育至胚胎泡期,用机械法去除胚泡透明带后,取出内细胞团,分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,进行传代培养。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷（SCD）小鼠体内畸胎瘤形成实验,对连续传代的细胞进行鉴定。结果：9枚受精卵在体外培养5-7d后,5个存活并发育为胚泡,取出的内细胞团经接种培养,3个内细胞团存活,呈克隆性生长,发育为胚胎干细胞,并连续体外传代7个月保持未分化状态,建系成功。3个细胞系分别命名为CHE1、CHE3和CHE3。取3个细胞系第5、15和30代的细胞进行碱性磷酸酶染色,均为阳性。对CHE3第25、30、40代、CHE1和CHE2第21、22、30代的细胞检测人胚胎干细胞表面标志SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和GCTM-2,结果均为阳性;检测小鼠胚胎干细胞表面标志SSEA-1,结果为阴性。染色体核型分析为二倍体核型。将连续传代5个月后（30代左右）的3个细胞系接种到SCID小鼠体内,6周后均形成畸胎瘤,组织病理学检查显示含有3个胚层的组织结构。结论：使用5个人受精卵来源的胚泡,成功地在体外建立了3个胚胎干细胞系,长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

小鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的:培养、分离和鉴定C57BL/ 6小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell ,ESC).方法:收集小鼠3.5 d 的囊胚进行培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ESC样集落,经两次亚克隆法分离培养成ESC;进行相差显微镜观察,采用阶段特异性胚胎抗原-1 (stage-spesific embryonic antigen,SSEA-1)对培养的ESC进行免疫组化染色. 结果:获得了稳定的ESC集落,传至第12代.ESC呈集落样生长,SSEA-1免疫组化染色强阳性.结论:两次亚克隆法获得的细胞具有ESC主要的生物学特性.     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

体外培养人胚晶状体上皮细胞生长特性的研究

目的观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞,通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜,采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近＂S＂形,经过1～2 d的潜伏期后进入对数生长期,需10 d左右达到融合,细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常,免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性。结论人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力,第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。     

LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化

目的构建LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞的扩增与诱导分化技术平台,为进行体内移植携带报告基因的神经干细胞研究奠定基础.方法利用无血清培养基,分离并体外培养LaZ转基因胚胎小鼠腹侧中脑神经干细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光、免疫细胞化学法及组织化学方法检测神经球Nestin和分化后细胞中神经纤维（NF）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）、Galc和半乳糖苷酶（X-Gal）的表达.结果从LaZ转基因小鼠腹侧中脑分离的细胞群具有连续形成神经球的能力,其Nestin表达阳性.分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原.所有细胞半乳糖苷酶组织化学均为阳性.结论LaZ转基因小鼠腹侧中脑神经干细胞可稳定扩增,具有多向分化潜能,分化后细胞携带LaZ报告基因,可用于进一步的移植实验研究.     

小鼠成纤维细胞饲养层的制备及C57BL/6小鼠胚胎干细胞系的建立

目的：制备小鼠成纤维细胞饲养层并建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ESC）系,为进一步建立人ESC系提供依据。方法：取妊娠12.5~14.5 d的胎鼠,组织消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）;收集C57BL/6小鼠3.5 d的囊胚培养于小鼠制作的饲养层上;分离内细胞团(ICM),扩增传代40代以上。观察ESC集落的生长情况。采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫组织化学早期胚胎特异性表面抗原(SSEA-1)、八聚体结合转录因子4(OCT-4)染色和体内分化实验对ESC集落进行鉴定。结果：分离培养后得到的ESC可稳定传代至40代以上,且均呈集落样生长。经AKP、SSEA-1和OCT-4染色后ESC均呈红褐色阳性表达,接种于裸鼠均可形成畸胎瘤;HE染色,有3个胚层组织成分。结论：成功建立了C57BL/6小鼠ESC系。