多聚乙烯亚胺介导IL-12基因增强裸鼠抗骨肉瘤免疫

目的 :观察以多聚乙烯亚胺 (polyethylenimine ,PEI)为载体 ,体内转染小鼠白细胞介素 12 (inter leukin 12 ,mIL 12 )基因 ,治疗裸鼠骨肉瘤模型的疗效。方法 :以PEI为载体 ,体外转染mIL 12基因入人骨肉瘤细胞 ,并观察此基因表达情况。建立裸鼠骨肉瘤动物模型 ,将PEI包裹mIL 12基因直接注入肿瘤局部 ,检测此基因的蛋白表达情况和小鼠脾脏自然杀伤细胞 (NK)活性。结果 :在PEI/DNA治疗组小鼠的肿瘤局部 ,mIL 12蛋白水平明显升高 ,小鼠脾NK细胞活性增强。结论 :PEI可以成功的将mIL 12基因导入裸鼠骨肉瘤模型 ,mIL 12基因治疗可提高机体的抗肿瘤免疫应答     

体外转染小鼠白细胞介素12基因抑制膀胱癌EJ细胞的实验研究

目的将含有小鼠白细胞介素12（mIL-12）全长基因的质粒转染到膀胱癌EJ细胞中,观察脾细胞对转染mIL-12膀胱癌细胞的杀伤作用。方法用脂质体转染法将含有mIL-12全长基因质粒转染到EJ细胞中,ELISA法检测IL-12表达水平。在脾细胞作用0～2 d时ELISA法连续检测上清干扰素γ（INF-γ）水平变化。转染后40 h加入制备好的小鼠脾细胞悬液约1×10^6作用24 h后,MTT法检测对膀胱癌细胞的抑制率。结果转染后40、60 h检测到IL-12的高表达（375±15） pg／ml和（400±50）pg／ml,较未转染组9～15 pg／ml明显增高;在EJ细胞表面可以检测到IL-12的表达,而对照组则无;加入脾细胞悬液1 d后,脾细胞加转染后的EJ细胞组的抑制率为58．7％（P〈 0．025）,而脾细胞加未转染EJ细胞组、单纯EJ细胞组以及转染的EJ细胞组差异无统计学意义（P〉 0．05）。脾细胞加入转染后EJ细胞上清24 h的。INF-γ为（155±21）pg／ml,与未转染组（65±8）pg／ml比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染mIL-12基因到膀胱癌EJ细胞中能够表达IL-12,在小鼠脾细胞存在的条件下,通过一系列的免疫调节作用,诱导T细胞、NK细胞等产生INF-γ等细胞因子从而杀伤膀胱癌细胞。     

聚乙烯亚胺介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察聚乙烯亚胺(PEI)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效率,从而优化可用于转染实验的条件.方法 利用细胞计数试剂盒(CCK-8)比色法检测0.2％～2.0％ PEI的细胞毒性,利用荧光显微镜和流式细胞仪测定N/P 3.97～ 37.75的转染效率、培养液中的氯喹(0～100 μmol/L)、10％白蛋白、5％血清及0～ 20 mmol/L Mg2+对PEI转染BMSCs效率的影响.结果 当完全培养基内的PEI浓度低于0.8％,BMSCs存活率为70％；N/P 15时PEI转染BMSCs的效率为14.4％；溶酶体抑制剂氯喹可增加PEI的转染效率,培养液中的10％白蛋白、5％血清及Mg2+可降低PEI转染效率.结论 PEI是一种有效的BMSCs非病毒转染剂.     

逆转录病毒携带白细胞介素-12转染树突状细胞体外诱导特异免疫杀伤肝癌细胞

目的探讨逆转录病毒携带白细胞介素(IL)12转染树突状细胞(DC)体外诱导免疫杀伤肝癌细胞的效能及其机制。方法感染指数(MOI)为100,含IL12的重组逆转录病毒修饰肝癌患者外周血DC(DCIL12),酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测DCIL12(5×103个/ml)培养上清中IL12和γ干扰素(IFNγ)水平,以冻融肝癌细胞株HepG2(1×107个/ml)所获得的肿瘤相关抗原(TAA)刺激DCIL12,MTT法检测TAA负载的DCIL12刺激同源T淋巴细胞(1×105个/ml)增殖分化能力,细胞毒试验检测DCIL12诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)及其上清液对HepG2肝癌细胞株杀伤作用,ELISA法检测CTL上清液IFNγ水平。结果DC经IL12基因修饰后48h分泌高水平IL12(24.35±5.40)ng/L及IFNγ(725±30)ng/L,均显著高于未转染DC组(P<0.01及P<0.05)。DCIL12诱导的CTL及其上清液对HepG2均有显著杀伤作用,杀伤率显著高于未转染DC组,分别为(82.43±8.70)%vs(57.4±4.3)%(P<0.01)和(76.45±8.50)%vs(18.23±5.30)%(P<0.01),DCIL12诱导的CTL上清液IFNγ水平显著高于未转染DC组,分别为(1125.0±32.7)ng/Lvs(281.3±14.7)ng/L(P<0.01)。结论IL12基因修饰增强DC体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫,其机制与IL12基因修饰促进DC分泌IL12、增强T淋巴细胞活化及分泌IFNγ密切相关。     

白细胞介素-12干扰RNA转染树突状细胞对其表型的影响

目的探讨白细胞介素（IL）-12p35亚基和IL-12p40亚基干扰RNA（IL-12 p35 siRNA，IL-12p40 siRNA）重组腺病毒载体感染树突状细胞（DC）后对其表型的影响。方法用重组腺病毒载体（Ad—IL-12p35 siRNA，Ad—IL-12p40siRNA，阴性对照Ad-HKsiRNA）感染DC，检测DC表面标志物MHCⅡ类分子和CDS0、CD86、CD11c的表达以及上清中IL-12p70和IL-10水平。结果IL-12p35 siRNA，IL-12p40siRNA重组腺病毒载体分别感染DC后，只有IL-12p35siRNA重组腺病毒载体感染DC上清中IL-12p70明显减少，IL-10明显升高，其表面标志物表达明显减少。结论IL-12p35亚基特异性siRNA转染DC后，降低了具有生物活性IL-12p70的浓度，提高IL-10的浓度，抑制MHC11类分子和CDS0、CD86、CD11c分子的表达。     

白细胞介素12基因转染抑制人胰腺癌细胞血管生成及肿瘤的生长

目的　探讨白细胞介素 (IL) 12基因转染人胰腺癌细胞对肿瘤的抑制作用及机制。方法　用逆转录病毒MFG作为载体 ,通过逆转录PCR和磷酸钙沉淀法将鼠IL 12基因转染导入人胰腺癌细胞PK 1,得到PK1/IL 12细胞。单纯用MFG感染PK1所得细胞命名为PK1/MFG。用ELISA方法检测IL 12产生量 ,用NK细胞抗体阻断NK细胞作用 ,比较活体及离体条件下两种细胞的增长曲线。活体显微镜下观察肿瘤细胞的血管生成及IL 12的抑制效应。结果　PK1/IL 12细胞株的IL 12产生量为 1 12 μg·ml-1·48h-1。离体条件下两种细胞的生长曲线相似 ,但在活体条件下PK1/IL 12细胞的生长被显著抑制 (P <0 0 1) ,其血管生成被完全阻断 ,正常毛细血管亦被破坏。结论　IL 12基因转染可以抑制人胰腺癌细胞的生长。在免疫缺陷条件下 ,IL 12的抗血管生成作用足以抑制肿瘤细胞的血管生成及肿瘤的生长。IL 12的血管生成抑制效应缺乏特异性。     

逆转录病毒载体介导白细胞介素-10基因转染对移植物保护作用

目的 研究逆转录病毒载体介导白细胞介素(IL)基因转染对移植物的保护作用。方法 一步法从磷脂多糖(LPS)刺激培养的脾细胞中提取细胞总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆出 IL-10的 cDNA。将IL-10 cDNA插入 pLNCX载体进行制备,用 PA317细胞包装pLNCX-IL10重组体,测定病毒滴度。建立大鼠异位心脏移植模型,心脏移植前通过冠状动脉灌注5×10~5 CFU的病毒原液转染移植心脏。观察移植心脏的存活时间,半定量 RT-PCR法检测移植心脏IL-10的转录水平,ELISA法检测IL-10的表达水平。结果 基因转染的移植心脏平均存活时间明显延长(33.0比8.5,P<0.01);RT-PCR在对照组未发现IL-10转录,而基因转染组4只移植心脏均有高水平IL-10转录;基因转染后 7 d IL-10的表达明显增加(316.8比 31.5,P<0.05),移植心脏输出静脉血 IL-10高于外周静脉(316.8比 176.2,P<0.05)。结论 通过冠状动脉灌注荷IL-10基因的逆转录病毒载体能够实现IL-10基因转染,延长移植物的存活。     

多脏衰患者外周血单核细胞TNF—α及IL—12mRNA表达研究

采用RT-PCR方法,对7例多脏衰患者外周血单核细胞的肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素12(IL-12)的mRNA表达水平进行观察。结果表明:多脏衰发生时,患者外周血单核细胞的TNF-α(P＜0.01)及IL-12(P＜0.05)的mRNA表达水平均较对照组明显升高。表明单核细胞在多脏衰发生时致损性细胞因子基因活化,细胞因子模板水平增加,进一步使致损因子的合成分泌增加,并参与过度炎症反应,此可能为腹腔感染导致多脏衰的原因之一。     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

癌胚抗原启动子正调控白细胞介素-15表达质粒载体的构建及其在肿瘤细胞中的靶向表达

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子正调控人白细胞介素-15(IL-15)真核表达质粒载体,观察其在肿瘤细胞内的靶向性表达.方法 基因克隆技术构建巨细胞病毒(CMV)启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CMV-TAT和CEA启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CEA-TAT;再以IL-2信号肽(SP)置换IL-15SP构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT;阳离子脂质体介导法体外转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染后48h细胞培养上清液中IL-15表达.结果 质粒均成功构建.ELISA检测结果:(1)以IL-2SP置换IL-15SP可提高转染细胞的IL-15表达4.8～5.9倍(P＜0.01);(2)转染SW480细胞后,CEA启动子正调控的两质粒(pHi2-IL-15-CEA-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT)与相对应的CMV启动子正调控质粒(pHi2-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT)之间的IL-15表达无统计学意义(P＞0.05),其效应等同于CMV启动子正调控质粒;(3)转染MCF-7细胞后,CEA启动子正调控的两质粒IL-15表达显著低于CMV启动子正调控质粒(P＜0.01).结论 CEA启动子正调控IL-15质粒,尤其是质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT在CEA阳性细胞中高表达IL-15,CEA阴性细胞中低表达IL-15,实现了IL-15基因高效、靶向性表达.     

携带小鼠白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞的作用

目的观察携带小鼠白细胞介素12(mIL12)基因的增殖型腺病毒载体对胃癌细胞的杀伤作用及mIL12表达情况。方法以携带目的基因的增殖型腺病毒CNHK200mIL12感染人胃癌细胞株SGC7901、人正常肝细胞株L02。首先,通过荧光显微镜下观察、细胞杀伤实验等观察病毒对细胞的杀伤能力;其次,通过Westernblot分析及双抗体夹心法(ELISA)检测mIL12表达情况。结果CNHK200mIL12感染SGC7901后,当MOI=10时即可杀伤大部分的肿瘤细胞,与ONYX015相当,而对正常细胞无明显杀伤。ELISA检测表明mIL12基因表达量达(267.2±34.6)ng/5×105个细胞/48h,较复制缺陷型腺病毒载体高近百倍。结论CNHK200mIL12能在胃癌细胞中复制及增殖杀死胃癌细胞,并高水平表达目的基因。     

转单链鼠白介素12基因前列腺癌RM-1细胞的致瘤性观察

目的：探讨前列腺癌的免疫基因治疗。方法：将mIL-12基因体外转染鼠前列腺癌RM－1细胞，接种C57BL／6小鼠，观察其致瘤性。结果：转基因RM－1细胞大部分丧失致瘤性；一侧接种转AdmIL-12的RM－1细胞，引起对侧接种野生型RM－1细胞成瘤延迟、肿瘤生长减缓。结论：IL－12可诱发抗肿瘤免疫反应。     

白细胞介素-12基因修饰对树突状细胞表面分子表达及细胞因子分泌的影响

目的 观察白细胞介素(IL)-12基因修饰对树突状细胞(DC)表面分子及细胞因子分泌的影响.方法 采用重组逆转录病毒介导IL-12基因修饰人外周血单个核细胞(PBMC)来源的Dc;ELISA法检测各组DCs和各组T细胞上清中IL-12、IL-10、IFN-γ因子的分泌水平;流式细胞仪(FACS)分析各组DC表面CD83、CD86的表达;MTT法检测DC刺激同源T淋巴细胞增殖的能力;统计学分析比较各组间的差异.结果 IL-12基因修饰使得DC高表达CD83和CD86分子,分泌高水平IL-12及IFN-γ,但对IL-10因子的分泌无明显影响,刺激同源T淋巴细胞增殖明显,诱导激活的T细胞上清中IFN-γ水平显著增高、IL-10分泌水平显著降低.结论 经IL-12基因修饰后的DC表型成熟,分泌IL-12及IFN-γ的能力增强,对IL-10因子的分泌无影响,能抑制T细胞分泌IL-10因子,优化抗原提呈的微环境.     

Antitumor effect of simultaneous transfer of interleukin-12 and interleukin-18 genes and its mechanism in a mouse bladder cancer model

BACKGROUND: The objectives of this study were to evaluate the antitumor effects of the simultaneous introduction of interleukin 12 (IL-12) and IL-18 genes into a mouse bladder cancer cell line (MBT2). We intended to compare these with those of either gene alone and to investigate the mechanism of the effects induced by the transfer of IL-12 and/or IL-18 genes in this model system. METHODS: We transfected the IL-12 and/or IL-18 genes into MBT2 cells by the liposome-mediated gene transfer method. We confirmed the secretion of IL-12 and/or IL-18 by enzyme-linked immunosorbent assay. Parental (MBT2/P), IL-12-transfected (MBT2/IL-12), IL-18-transfected (MBT2/IL-18) or both IL-12- and IL-18-transfected (MBT2/Both) cells were subcutaneously or intravenously injected into syngeneic C3H mice. To analyze the mechanism of tumor rejection, these clones were subcutaneously injected into naive nude mice and those depleted with natural killer (NK) cells by antibody. RESULTS: MBT2/IL-12, MBT2/IL-18 and MBT2/Both were completely rejected when they were injected subcutaneously or intravenously into syngeneic mice. However, MBT2/IL-12, but not MBT2/IL-18, could grow in nude mice. Moreover, the antitumor effect of MBT2/IL-18 was partially abrogated when injected into nude mice of which NK cells were depleted by antibody treatment. MBT2/Both was completely rejected in both nude mice with and without NK cells. CONCLUSION: The results of the present study indicate that T cells and NK cells seem to play important roles in the antitumor effects by the secretion of IL-12 and IL-18, respectively, and MBT2/Both possesses both mechanisms.     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。     

重组蛋白sCAR-TMTP1增强腺病毒对骨肉瘤细胞基因转染效率的研究

目的 提高腺病毒(adenovirus,ADV)在缺乏柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor,CAR)的骨肉瘤细胞中的转染效率.方法 通过昆虫(Bac-to-Bac)杆状病毒表达系统表达含有CAR胞外段(sCAR)及TMTP1肽的重组蛋白(sCAR-TMTP1),并对其纯化、鉴定.流式细胞仪分别检测骨肉瘤细胞及人胚肾细胞293(HEK293)的CAR表达水平,ADV对其的感染效率及FITC-TMTP1的结合能力.重组蛋白sCAR-TMTP1与ADV共同孵育形成复合物,流式细胞仪研究其在缺乏CAR的骨肉瘤细胞(MG-63)中的转染效率.结果 表达及纯化的sCAR-TMTP1蛋白在相对分子质量约31000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠sCAR单克隆抗体发生特异性反应.MG-63可与FITC-TMTP1特异结合,其CAR表达水平低,ADV转染效率低.经sCAR-TMTP1修饰后的ADV/GFP对MG-63细胞的感染效率显著高于未经修饰的含报告基因GFP的ADV(ADV/GFP).结论 重组蛋白sCAR-TM-TP1可显著提升ADV对缺乏CAR的骨肉瘤细胞的转染效率.