ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

siRNA沉默ZNF580基因对内皮细胞MMP-2的表达及侵袭能力的影响

【目的】观察ZNF580基因沉默后内皮细胞MMP-2的表达及迁移和侵袭能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】针对ZNF580基因不同部位设计并化学合成3对不同靶向小干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染EA.hy926内皮细胞;应用半定量RT-PCR、Western blotting及明胶酶谱检测转染前后内皮细胞ZNF580和MMP-2 mRNA、蛋白的表达及活性变化;运用划痕愈合实验和Transwell小室模型检测转染前后内皮细胞迁移和侵袭能力的改变。【结果】筛选出最佳干扰序列siRNA序列3;下调ZNF580基因表达后,MMP-2 mRNA的表达及明胶酶的活性均下调(P<0.05),且内皮细胞体外迁移和侵袭能力显著降低(P<0.01)。【结论】ZNF580在内皮细胞运动转移过程中具有重要作用,可能成为肿瘤基因治疗的一个新靶点。     

片仔癀对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 观察片仔癀对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移的影响,并探讨其作用机制.方法 用MTT法检潮片仔癀对HUVEC增殖的影响,用划痕损伤实验观察片仔癀对HUVEC的迁移的影响.结果 片仔癀干预6、12、24、48 h后,与空白对照组比较,各剂量组抑制HUVEC的增殖能力(P＜0.01),且有剂量和时间依赖;片仔...     

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。     

八宝丹对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察八宝丹(BBD)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移能力的影响。方法体外培养HUVEC,使用不同浓度BBD进行干预,MTT法检测HUVEC增殖情况,倒置显微镜观察细胞形态、划痕损伤,Transwell实验观察细胞损伤修复及迁移能力。结果 BBD能显著降低HUVEC的活力,抑制HUVEC增殖,抑制HUVEC的损伤修复和迁移能力,并呈现剂量依赖性。结论 BBD具有抑制HUVEC增殖和迁移的作用。     

CD40-CD40L相互作用对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

目的 探讨CD40-CD40配体相互作用对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖及迁移的影响。方法 采用Ⅱ型胶原酶消化法培养人脐静脉内皮细胞，以^3H-胸腺嘧啶脱氧核苷（^3H-TdR）、^3H-亮氨酸（^3H-Leu）掺入法分别测定HUVEC增殖，内皮细胞的迁移采用琼脂糖凝胶刮取法，倒置显微镜观察。结果 CD40-CD40配体相互作用能明显促进HUVEC ^3H—TdR．^3H—Leu的掺入，两者具有时间、剂量依赖性，CD40-CD40配体相互作用随CD40L浓度的增加及刺激时间延长（30h内），能明显增加内皮细胞迁移率，anti-CD40单克隆抗体能明显抑制上述效应。结论 CD40-CD40配体相互作用能促进内皮细胞增殖、迁移。     

不同浓度过氧化氢对人脐静脉内皮细胞增殖活性的影响

目的 建立氧化应激损伤模型,研究过氧化氢（H₂0₂）对内皮细胞增殖活性的影响,为深入探讨氧化应激致血管内皮细胞损伤机制奠定基础。方法 以0、50、100、150、300、400和600μmol/L H₂0₂作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,在8、12和24h时间段内采用MTT法测定细胞的增殖活性。结果 50μmol/L H₂O₂作用8h对HUVEC活性无影响,与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）;其余各浓度各时间段内,H₂O₂均可引起细胞活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。各两组比较,8h组与12h组、24h组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;12h组与24h组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。12h的IC₅₀为133.3μmol/L。结论 在一定浓度时间范围内,H₂0₂对HUVEC有增殖抑制作用,150μmol/L H₂O₂处理12h为最佳实验浓度时间。     

钩吻总碱对人脐静脉内皮细胞增殖及迁移的影响

目的探讨钩吻总碱对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及迁移的影响。方法用钩吻总碱干预体外培养HUVEC,用MTT法、倒置显微镜观察和DAPI染色法观察钩吻总碱对HUVEC生长、增殖及形态的影响。利用划痕实验,观察钩吻总碱对于HUVEC迁移的影响。结果与对照组相比,钩吻总碱各剂量组干预24 h后HUVEC的迁移明显减少,干预48 h后HUVEC的增殖减少、凋亡增加,表现出一定剂量依赖性。结论钩吻总碱能有效地抑制HUVEC的增殖,促进HUVEC的凋亡,并且可抑制HUVEC的迁移。     

bFGF对缺氧条件下培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对缺氧条件下培养内皮细胞增殖的影响,探讨其在缺氧条件下促血管再生的作用机理。方法：在细胞生长至70％－80％融合后，在细胞中加入bFGF后缺氧培养，通过流式细胞仪检测bFGF对细胞周期的影响。结果：流式细胞仪检测发现bFGF可使缺氧培养的内皮细胞的PI值和SPF值增加。结论：结果表明bFGF可逆转缺氧所致的内皮细胞增殖能力下降，使SPF和PI值上升。     

bFGF对缺氧条件下培养的人脐静脉内皮细胞增殖影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对缺氧条件下培养内皮细胞增殖的影响,探讨其在缺氧条件下促血管再生的作用机理。方法:在细胞生长至70％-80％融合后,在细胞中加入bFGF后缺氧培养,通过流式细胞仪检测bFGF对细胞周期的影响。结果:流式细胞仪检测发现bFGF可使缺氧培养的内皮细胞的PI值和SPF值增加。结论:结果表明bFGF可逆转缺氧所致的内皮细胞增殖能力下降,使SPF和PI值上升。     

肝细胞生长因子促血管内皮细胞增殖及迁移的研究

目的:探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响及其促血管生成作用.方法:从脐静脉体外分离培养HUVEC,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察rhHGF对HUVEC的增殖作用,倒置显微镜观察HUVEC的迁移,透射电镜观察超微结构的改变及流式细胞仪检测细胞周期的改变.结果:(1)rhHGF对培养的HU-VEC有显著的促增殖和迁移作用,且成浓度和时间依赖性.(2)rhHGF促使HUVEC细胞超微结构的改变,线粒体和粗面内质网增多,常染色质增多(3)细胞周期分布改变:S期、G2/M期细胞增多.结论:rhHGF能显著促进HUVEC的增殖和迁移,提示其可能具有促血管生成作用.     

雌激素受体激动剂对人脐血内皮祖细胞增殖和迁移的影响

目的:观察选择性雌激素受体(ER)激动剂PPT(α亚型激动剂)和DPN(β亚型激动剂)对人脐带血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells EPCs)增殖和迁移的影响,并与17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的作用进行比较。方法:采用密度梯度离心法分离获得脐带血单个核细胞,硫氰酸荧光素标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)双染及CD133免疫荧光鉴定EPCs。培养的EPCs分别加入不同浓度的E2、PPT和DPN(分别为1×10-10mol/L、1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L)进行细胞增殖实验分析(WST)、显微镜下EPCs计数及Transwell技术测定对EPCs迁移的影响。结果:E2及PPT呈浓度依赖性促进EPCs的增殖和迁移,PPT刺激作用等同于E2,DPN无刺激作用。结论:雌激素α亚型激动剂PPT明显刺激内皮祖细胞的增殖和迁移,其作用与17β-雌二醇相同。     

补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察不同浓度补阳还五汤(BYHWD)含药血清对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)增殖和迁移影响。方法补阳还五汤灌胃SD大鼠后腹主动脉取血,制备含药血清;体外培养人脑微血管内皮细胞(HBMECs),随机分为空白组(正常大鼠血清)及补阳还五汤含药血清组,血清浓度分为5%、10%和20%3个浓度,共6组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HBMECs增殖;细胞划痕法检测HBMECs迁移的相对距离。结果与空白组比较,5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖,差异有统计学意义(0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67±0.05,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少,差异有统计学意义(0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05,P0.05)。与空白组比较,各含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加,差异有统计学意义(0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53±0.05比0.45±0.04,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小,差异有统计学意义(0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03,P0.05)。结论补阳还五汤含药血清可促进HBMECs增殖和迁移,10%含药血清作用最佳。     

绿色荧光蛋白报告基因与ZNF580基因重组真核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建具有绿色荧光蛋白报告 (GFP)基因的ZNF5 80真核表达载体 ,为转染细胞提供基础。【方法】根据ZNF5 80cDNA序列的开读框架设计上、下游引物 ,利用PCR技术扩增ZNF5 80cDNA开放阅读框序列 ,将PCR目的片段与PGEM T载体连接并克隆 ,酶切含目的片段PGEM T质粒及 pEGFP C1载体 ,回收纯化后做定向克隆连接 ,BglⅡ及HindⅢ双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】酶切 pEGFP C1 ZNF5 80 ,电泳分析插入片段长度为 :5 2 4bp ,与预期的结果一致 ,经连接点两端进行测序 ,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建真核表达载体pEGFP C1 ZNF5 80。     

米非司酮对人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的作用

目的 :研究米非司酮 (MIF)对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖与凋亡的作用。方法 :应用MTT比色法观察MIF对HUVEC细胞生长的影响 ;采用形态学观察、流式细胞术、免疫组织化学、DNA缺口原位末端标记法 (TUNEL)观察MIF作用前后HUVEC细胞增殖与凋亡变化。结果 :不同浓度MIF均能抑制HUVEC细胞生长。MIF≤ 2 0 μmol L对细胞生长的抑制作用在第 2 4h达高峰 ,此后呈下降趋势。MIF >2 0 μmol L对细胞生长产生剂量依赖性抑制作用。用 4 0 μmol L的MIF处理 72h后 ,HUVEC细胞的增殖降低、凋亡率增加 ,P<0 .0 0 0 1;且伴随ER PR、VEGF表达的下降。结论 :MIF具有抑制HUVEC细胞增殖、诱导HUVEC细胞凋亡的作用。     

ZNF580与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HEK293细胞的表达和定位

[目的]构建人ZNF580与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体,转染细胞进行瞬时表达,分析ZNF580-EGFP融合蛋白在人胚肾HEK293细胞中的表达和亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增ZNF580基因cDNA开放阅读框架全编码区（编码1-172位氨基酸）、N端编码区（编码1-93位氨基酸）、C端编码区（编码94-172位氨基酸）,分别克隆到真核表达载体pEGFP-C1,BglΠ及HindШ双酶切筛选鉴定并测序。荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在HEK293细胞中的表达及亚细胞定位。[结果]pEGFP-ZNF580（1-172）、pEGFP-ZNF580（94-172）表达的ZNF580-EGFP融合蛋白聚集于HEK293细胞核。[结论]ZNF580蛋白的核定位信号位于其C端C2H2型锌指主构域（94-172位氨基酸区间）。     

磷酸酶PHLPP1转基因对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 探讨磷酸酶PHLPP1在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的基础表达及转基因对其增殖的影响.方法 体外培养的HUVEC分3组处理,分别为未转染组、转染pcDNA3-GFP组和转染pcDNA3HA-PHU)P组.通过构建pcDNA3HA-PHLPP1质粒并瞬时转染HUVEC.以细胞计数及噻唑盐比色法测定细胞增殖能力2.Western blot ting定量磷酸酶PHLPP1蛋白表达水平.结果 基础状态下HUVEC不表达PHLPP1.转染pcDNA3HA-PHLPP1组明显增加PHLPP1表达,与正常对照组、pcDNA3-GFP组比较差异显著(均P<0.01).3组的细胞增殖指标无明显差异(P>0.05),其中MTT吸收度A值分别是0.134±0.015,0.133±0.014,0.137±0.016,细胞计数为(8.293±0.962)×105,(7.937±0.101)×105,8.127±0.112×105.结论 PHLPP可能不是调节HUVEC增殖的最重要信号蛋白.     

茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖作用的研究

目的探讨茶多酚（TP）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）生长增殖的影响。方法采用二因素3×5析因设计及噻唑兰（MTT）比色法检测不同作用时间及剂量的仲对HUVEC的生长增殖作用，采用倒置相差显微镜观察HUVEC形态的变化。结果在24h时间段，120，160,240mg／L组，在48，72h时间段，80、120、160、240mg／L组与对照组吸光度有显著性差异。24，48，72h的半数抑制浓度分别是184．41，127．70，108．98mg／L。且TP作用时间与剂量之间有交互作用。结论TP能抑制HUVEC增殖且具有量效一时效依赖关系。