柔嫩艾美尔球虫EGF-like结构域基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）微线蛋白4（EtMIc4）的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like（390bp）基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白结合作用的研究

目的研究刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白之间的结合特性。方法采用PCR方法扩增弓形虫RACK1基因,双酶切后与pGEX-4T-1连接,构建原核表达载体pGEX-4T-1-RACK1,转化入BL21大肠埃希菌中,用0.8mmol/L IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE检测并进行Ni-IDA亲和层析纯化,采用Western blot分析RACK1蛋白与PKC蛋白的结合作用。结果 PCR扩增出966bp的RACK1基因开放读码框,成功构建pGEX-4T-1-RACK1原核表达载体,转化BL21后用IPTG诱导4h~6h,SDS-PAGE检测到约36ku的表达产物,Western blot检测RACK1蛋白能与PKC蛋白结合。结论成功构建了pGEX-4T-1原核表达载体,表达产物RACK1蛋白能与PKC蛋白结合。     

肺孢子虫（菌）p55抗原嵌合基因的克隆及表达产物分析

目的构建肺孢子虫（菌）p55蛋白嵌合基因的原核表达载体,分析、鉴定及纯化表达产物。方法自NCBI网站的蛋白数据库中获取p55抗原及4个变异体信息,运用生物信息学方法预测可能的抗原表位,设计包含多个可能抗原表位的多肽,根据遗传中心法则及大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,将氨基酸序列转化为核苷酸序列,将人工合成的嵌合基因（CAG）片段连接到质粒pGEX-6p-1（含GST标签）上,构建原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,酶切、测序鉴定。pGEX-6p-1/CAG转化大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组融合蛋白CAG-GST。表达产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western-blotting分析鉴定。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pGEX-6p-1/CAG构建成功。SDS-PAGE显示重组融合蛋白相对分子量约为69 000。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白为CAG-GST。结论成功构建表达p55蛋白嵌合基因的原核表达载体pGEX-6p-1/CAG,建立表达重组蛋白的原核表达系统。     

单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因的原核表达

目的为获得大量的单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lmo）溶血素（Hemolysin，hty）蛋白，以便研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制方面的作用。方法本文应用Primer Premier5．00设计引物，引入13amHI和x幻工酶切位点。以前期合成构建的pMDl8-T-hly质粒为模板，通过PCR方法扩增出Lmo0586株溶血素基因。相应酶切后，克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建pGEX-6p-hly重组质粒，转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。带有重组质粒pGEX-6p-hly的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，进行SDS-PAGE及免疫印记分析。结果PCR体外扩增hly基因产物大小约为1624bp，成功构建了重组表达质粒pGEX-6p—hly；SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为72ku，重组蛋白主要以包涵体形式表达。表达量占菌体总蛋白的20．8％；Western免疫印记表明具有良好的反应原性。结论在国内首次构建重组质粒pGEX-6p-hly，并以融合蛋白的形式进行了高效表达，同时该蛋白具有特异的抗原反应性，为研制Lmo诊断试剂及其在疫苗研制中的作用奠定了基础。     

嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达

目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核表达质粒的构建与表达

目的 构建卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核重组表达质粒，表达重组蛋白。 方法 SD大鼠皮下注射免疫抑制剂地塞米松14周，建立卡氏肺孢子虫大鼠模型。从感染大鼠肺组织中抽提总RNA，RT-PCR克隆p55基因，测序, 验证扩增产物。利用定向克隆技术将p55基因片段克隆到载体pGEX-4T-1上，重组质粒经酶切分析、PCR鉴定后，用异丙基?鄄β?鄄D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。最后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定表达产物。 结果 克隆的p55基因片段为690 bp, 重组质粒pGEX-4T-1/690构建成功； SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量(Mr)约为62 000，表达产量约占菌体蛋白的11.6%；Western blotting分析结果显示，表达蛋白能分别与谷胱甘肽（GST）抗体、卡氏肺孢子虫感染的大鼠血清发生反应。 结论 构建了卡氏肺孢子虫p55抗原基因的pGEX-4T-1/690重组质粒，诱导表达的蛋白具有良好的抗原性。     

弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白基因的序列分析及其在大肠埃希菌中的表达

目的?摇分析弓形虫不同分离株致密颗粒蛋白7（dense granule protein,GRA7)基因的异同及在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白。 方法 从弓形虫不同分离株（RH株、ZS2株和GT株）的基因组中特异地扩增出GRA7基因，将目的基因定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠埃希菌JM109并测序。利用互联网上的在线工具CLUSTALW进行序列分析。异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）体外诱导pGEX-4T-1/GRA7重组质粒菌的表达，对表达的目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），分别以抗抗谷胱甘肽巯基转移酶（GST）抗体、人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western blotting分析。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，ELISA 法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。 结果 弓形虫不同分离株GRA7的基因序列相同；pGEX-4T-1/GRA7重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白，Western blotting分析表明该蛋白为GST融合蛋白，且能被人抗弓形虫阳性血清所识别；ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、兔抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。 结论 弓形虫不同分离株GRA7基因具有高度保守性；GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达，且该重组蛋白具有一定免疫反应性。     

弓形虫致密颗粒蛋白基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的 将克隆入pGEX-4T-1的致密颗粒蛋白基因进行表达并对表达产物的免疫反应性进行评价。方法 将重组表达质粒pGEX-4T-1／GRA7转入大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导进行SDS变性蛋白质电泳，分别以Anti-GSTAn-tibody、免抗弓形虫阳性血清和人抗弓形虫阳性血清为一抗进行Western Blot分析。用GSTrap FF HiTrap affinity columns纯化重组蛋白，以此蛋白作为包被抗原，BLISA法检测抗弓形虫阴性、阳性血清。结果 SDS变性蛋白质电泳显示在43KDa～66KDa蛋白条带之间有特异蛋白的表达，蛋白分子量大小与理论值相符。Western Blot分析表明该重组蛋白为GST融合蛋白，且该蛋白能被人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清所识别。ELISA结果表明该蛋白能与人抗弓形虫阳性血清、免抗弓形虫阳性血清特异结合，而与抗弓形虫阴性血清无反应。结论 弓形虫致密颗粒蛋白基因在大肠埃希菌中得到表达；该重组蛋白具有良好的免疫反应性。     

融合基因IFN-α1b/CSPⅡ原核表达载体的构建及在大肠埃希菌中的表达

目的　构建融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体并予以表达。　方法　采用聚合酶链反应(PCR)从人基因组DNA中扩增出IFN α1b基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b。利用PCR法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出环子孢子蛋白Ⅱ区 (CSPⅡ )基因 ,克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1,构建原核表达载体pGEX 4T 1/CSPⅡ 。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ将IFN α1b从原核重组质粒 pGEX 4T 1/IFN α1b中切下 ,克隆入经相同酶切的原核重组质粒pGEX 4T 1/CSPⅡ 中 ,构建融合基因的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ。融合基因IFN α1b/CSPⅡ经异丙基 β D硫代半乳糖苷 (IPTG )诱导 ,在大肠埃希菌中进行初步表达。结果　构建的原核表达载体 pGEX 4T 1/IFN α1b、pGEX 4T 1/CSPⅡ和 pGEX 4T 1/IFN α1b/CSPⅡ经PCR和酶切鉴定与预期结果一致。证实融合基因IFN α1b/CSPⅡ拼接成功并正确地克隆入原核表达载体。在大肠埃希菌中表达出融合蛋白IFN α1b/CSPⅡ ,该融合蛋白经十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析与理论预测值相符。经蛋白质印迹法 (Westernblotting)鉴定具有免疫原性。　结论　构建了融合基因IFN α1b/CSPⅡ的原核表达载体 ,并在大肠埃希菌中表达了。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

日本血吸虫组织蛋白酶L1基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在原核表达体系大肠埃希菌中进行日本血吸虫组织蛋白酶L1(SjCL1)基因表达。　方法　通过PCR从质粒pcDNA3-SjCL1中扩增得到SjCL1基因 ,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T -1中 ,构建重组质粒pGEX-SjCL1,将该重组质粒转化大肠埃希菌JM109,转化子经异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷诱导表达 ,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)和蛋白质印迹法 (Westernblotting)分析SjCL1基因表达产物。　结果　获得长约 1kb的PCR片段 ,构建了pGEX-SjCL1质粒。SDS-PAGE和Westernblotting检测表达产物 ,相对分子质量为 62 0 0 0。　结论　SjCL1基因在大肠埃希菌中以融合形式得到表达。     

微小牛蜱Bm86基因的原核表达与表达条件的优化

根据微小牛蜱Bm86基因序列设计引物,在重组质粒pMD18-T-Bm86中克隆,并将其定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）株,用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同时间进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测结果表明,37 ℃条件下经1 mmol/L IPTG诱导8 h后,目的重组蛋白表达量最大,表达相对分子质量（Mr）约为94 000的包涵体蛋白,与预期大小一致,目的蛋白约占蛋白总量的29%。蛋白质印迹（Western blotting）分析表明,该重组蛋白可被兔抗微小牛蜱全蜱阳性血清所识别。     

GST—FHL2融合蛋白的表达及纯化

目的高效表达和纯化可溶性GST—FHL2融合蛋白。方法（1）PCR法扩增FHL2（Four and a half LIM domains2）基因的编码片段，分别在5′端和3′端加上EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，并克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1；（2）利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组质粒pGEX4T-1-FHL2在大肠杆菌B121（DE3）中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签的融合蛋白；（3）超声法裂解大肠杆菌，应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST—FHL2融合蛋白；（4）通过SDS—PAGE和Western blot验证GST—FHL2的表达。结果（1）成功构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，测序结果证明FHL2与载体的GST在同一读框；（2）0．1mmol／L的IPTG在23℃的条件下能诱导可溶性GST—FHL2融合蛋白高效表达；（3）在Western blot分析中，GST—FHL2能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别，条带所在位置和GST-FHL2的分子量相符。结论正确构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒，在大肠杆菌BL21中高效表达GST—FHL2融合蛋白，经谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性GST-FHL2融合蛋白。