利用PCR技术检测阴道毛滴虫体内的人型支原体

采用人型支原体16S rDNA的特异引物，对从广州市多所医院门诊患者分离到的28株阴道毛滴虫进行PCR检测，结果有12株感染了人型支原体，感染率为42.9%。这显示了阴道毛滴虫和人型支原体之间的共生关系在中国具有普遍性。     

人型支原体共生与阴道毛滴虫甲硝唑耐药性的关系

目的研究人型支原体(Mycoplasma hominis)的共生与阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)甲硝唑耐药性的关系。方法2010年11月至2011年7月,自四川省妇幼保健院妇科门诊患者生殖道分泌物中分离出160株阴道毛滴虫,用梯度浓度1 024、512、256……4、2和1μg/ml甲硝唑分别处理该批虫株,以死亡率≥90%的最低浓度作为甲硝唑最小致死浓度(MLC)。以160个阴道毛滴虫分离株中提取的DNA为模板,用PCR技术特异性扩增人型支原体16S rRNA基因,检测滴虫细胞内是否有人型支原体共生。对检出人型支原体DNA的分离株用32μg/ml多西环素清除支原体,比较清除前后甲硝唑MLC的变化。结果 160个阴道毛滴虫分离株中甲硝唑MLC为1～8μg/ml的占61.3%(98/160),16～32μg/ml的占26.3%(42/160),64～256μg/ml的占12.5%(20/160)。PCR检测结果显示,有61株(38.1%)检出人型支原体DNA,其中MLC为1～8μg/ml的分离株检出率为13.3%(13/98),16～32μg/ml的分离株检出率为73.8%(31/42),64～256μg/ml的分离株检出率为85.0%(17/20),不同MLC范围的分离株人型支原体检出率差异有统计学意义(P<0.01)。用多西环素处理后,61株中仅有8株支原体被清除,清除前后甲硝唑MLC无明显变化。结论四川地区的阴道毛滴虫分离株对甲硝唑表现出一定程度的耐药性,人型支原体的共生可能与之有关,但尚未发现直接证据。     

阴道毛滴虫7个分离株表面黏附蛋白33基因序列比较

目的　分析我国阴道毛滴虫7个分离株表面黏附蛋白33(AP33)基因的遗传多态性。　方法　抽提基因组DNA,用特异引物PCR扩增AP33基因、测序、分析其同源性并构建系统进化树。用甲硝唑体外分别作用于7个分离株,得其最小致死量(MLC)。　结果　阴道毛滴虫北京1、2株,唐山株 承德株、九江 1、2、3株7个分离株AP33基因与Gen Bank中U87098株同源性高达98.2 %～100%,属同型虫株。其中承德株和U87098株北京1株和唐山株北京2株和九江3株九江1株和九江2株各形成一个分支,两两之间具有较近的亲缘关系。7个分离株的地理来源与其进化关系未见相关性。　结论　阴道毛滴虫7个分离株AP33基因的遗传关系密切,属同型虫株,但其基因序列存在一定差异。亲缘关系较近的虫株间甲硝唑MLC值相差较大。     

阴道毛滴虫ap33基因克隆及其表达载体的构建

目的 研究阴道毛滴虫粘附蛋白AP33的基因结构特点并构建其表达载体。方法 提取阴道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR得到阳性克隆,将其亚克隆到pLICm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与CenBank中核苷酸序列进行同源性分析。再将亚克隆与表达载体分别酶切并连接。结果 阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为927bp,,ap33与国外已报道的3株T.vaginalis的ap33基因分别具99％、97％、94％的同源性。结论 成功克隆出阴道毛滴虫ap33基因序列,与已公布的ap33序列有很高的同源性。构建获得PET-32a(+)-ap33重组质粒,可在原核中进一步表达特异性蛋白。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的免疫保护机制初探

目的探讨阴道毛滴虫重组AP33融合蛋白对宿主的保护性免疫机制。方法用纯化的重组AP33蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清和脾细胞多项免疫指标的变化;实验组与对照组分别用滴虫滋养体进行皮下和腹腔攻击,观察各组小鼠的行为变化和死亡时间。结果重组AP33蛋白免疫小鼠产生高效价抗体;实验组小鼠的CD4+T淋巴细胞有所增高(30.65±3.69)%,CD4+/CD8+比值明显升高(3.96±0.56)%(P<0.01);脾细胞培养上清液中mIL-2、mIFN-γ、mIL-4和mIL-6均有不同程度的升高,尤其mIFN-γ浓度增高最明显;皮下注射组,实验组小鼠背部出现明显溃疡;腹腔注射组,对照组小鼠6d内全部死亡,而实验组小鼠的存活时间比对照组长,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组AP33融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生较好的免疫保护作用,可能成为阴道毛滴虫预防或治疗性多价疫苗的侯选抗原。     

阴道毛滴虫对甲硝唑的耐药性分析

目的研究阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalisvirus)对甲硝唑的耐药性,探索共生人型支原体对其耐药性的影响。方法由医院提供阴道毛滴虫样品,对其进行体外培养,达到纯培养后提取虫株核酸,进行扩增及测序;制备浓度梯度板,测定甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度(minimum lethallon centration,MLC),并将人型支原体进行序列分析和清除后再测定DNA及MLC,并作前后比较。结果甲硝唑对34株阴道毛滴虫MLC范围为1~300μg/ml,其中敏感性较高的共有21株,9株敏感性略低,4株敏感性低;在人型支原体共生与甲硝唑MLC关系测定中,12株扩增出特异性产物(长度大小约为530bp),阳性率为35.3%。DNA检测阳性的12株阴道毛滴虫中,甲硝唑MLC在1~25μg/ml、50~70μg/ml和100~300μg/ml范围内的虫株共生率分别为14.3%、66.7%和75.0%。当MLC在300μg/ml时,有2个虫株呈现人型支原体共生现象,显示人型支原体共生状态与甲硝唑MLC之间存在一定的关联性;清除人型支原体后的甲硝唑MLC测定中,加入多西环素并对虫株进行传代培养。当传至3代后进行检测,12株阳性虫株中仅有7株未再检出人型支原体DNA,其中甲硝唑敏感株的4株MLC无变化,对甲硝唑耐药的3株MLC略有降低,但仍维持在较高水平。结论甲硝唑MLC不同的阴道毛滴虫虫株人型支原体的共生情况也不同。对甲硝唑耐药性越强的虫株人型支原体检出率越高,甲硝唑MLC为300μg/ml的虫株均查出人型支原体,表明阴道毛滴虫对甲硝唑的耐药性与人型支原体共生现象可能存在一定关系。     

抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的 制备阴道毛滴虫（T.υ317株）黏附蛋白抗原（AP33）单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。　方法　将制备和纯化的融合黏附蛋白33（rAP33）为抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次（抗原含量分别为100、50和100 μg），每次间隔2周，末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行细胞融合，筛选出高滴度分泌的McAb 杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹（Western blotting）分析其特异性，间接免疫荧光实验（IFAT）进行定位，并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。 结果 经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株（4A2， 4F11， 4F8， 4E7和4H11）杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示，5 株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合；IFAT显示其中4株（4F11， 4F8， 4E7， 4H11）可识别培养的阴道毛滴虫，体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200 μg/ml，该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50.08%、65.03%、50.70%和49.08%。 结论 制备的抗重组AP33单克隆抗体，体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。     

阴道毛滴虫AP65基因克隆与序列分析

目的对阴道毛滴虫黏附蛋白AP65基因的克隆与序列分析。方法提取阴道毛滴虫总RNA为模板，根据GenBank中发表的阴道毛滴虫黏附蛋白AP65序列设计一对引物，经RT-PCR得到与预计大小相一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析。结果目的基因片段长度为1704bp，其序列与阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-3、阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-2、阴道毛滴虫黏附蛋白AP65-1的同源性分别为97．2％、94．4％和86．7％。结论成功克隆出阴道毛滴虫AP65基因，与已发表的AP65-3序列的同源性最高，本研究为进一步研究阴道毛滴虫的致病机理，寻求更好的阴道毛滴虫病防治方法奠定基础。     

解脲支原体及阴道毛滴虫感染与宫颈糜烂相关性调查

目的 了解芜湖市部分事业单位妇女中宫颈糜烂的发病情况及解脲支原体、阴道毛滴虫与宫颈糜烂的相关性,为宫颈糜烂的有效治疗提供依据.方法 用阴道窥阴器检查宫颈糜烂情况.收集阴道及宫颈分泌物,用悬滴法及荧光定量PCR法分别检测阴道毛滴虫及解脲支原体.结果 宫颈糜烂的发病率为66.667％;解腺支原体的阳性率为61.167％;阴...     

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

阴道毛滴虫病毒对虫体基因多态性的影响

目的分析阴道毛滴虫病毒对阴道毛滴虫临床分离株基因多态性的影响。方法用MGE-PCR扩增阴道毛滴虫病毒阳性株和病毒阴性株Tvmar1基因位置,应用软件MEGA 5.0构建系统进化树。结果阴道毛滴虫临床分离株之间的遗传差异明显,6株阴道毛滴虫病毒阳性株之间的遗传距离较近,分布在同一分支上。结论阴道毛滴虫病毒会对阴道毛滴虫的基因多态性产生影响。     

阴道毛滴虫病毒介导的EGFP在阴道毛滴虫细胞内的表达

目的研究阴道毛滴虫病毒(Trichomonas vaginalis virus,TVV)介导外源基因进入阴道毛滴虫体内表达的能力,探索TVV作为双链RNA病毒转染载体的可能性。方法根据TVV基因组的序列特征,用绿色荧光蛋白(EG-FP)编码基因替换TVV的全部或部分基因编码区,构建TVV与增强型EGFP编码基因的嵌合体pTVV-EGFP,其体外转录体经电穿孔方法转染携病毒阴道毛滴虫株,RT-PCR及SDS-PAGE方法检测EGFP的表达情况。结果电穿孔转染后培养的虫体在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,且续传15代后仍然存在;RT-PCR检测到EGFP的mRNA,SDS-PAGE检测到转染后虫体及培养上清中有分子质量单位为27 ku的蛋白,与已知EGFP的分子质量相符。结论TVV能成功介导外源性EGFP编码基因在阴道毛滴虫体内表达。     

不同地域阴道毛滴虫品系的同工酶电泳分析

目的研究中国大陆不同地域(北京、河北唐山、河北承德、江西九江)阴道毛滴虫7个分离株的生物学类型。方法用聚丙烯酸胺凝胶电泳(PAGE)、同工酶染色、聚类分析方法进行分析。结果检测MDH、LDH、G-6-PD、PGI、PGM等5种酶的同工酶。在G-6-PD、PGI酶谱中,7株完全相同。在MDH、LDH酶谱中,北京1株、北京2株、九江3株完全相同,而与承德株、唐山株、九江1株、九江2株不同。在PGM酶谱中,北京1株、北京2株完全相同,而与承德株、唐山株、九江1株、九江2株、九江3株不同。并依酶谱绘制系统进化树。承德株、唐山株、九江1株、九江2株与北京1株、北京2株、九江3株大多数同工酶谱存在显著差异,九江3株与北京1株、北京2株在5个同工酶谱中存在微小差异。结论我国阴道毛滴虫虫株可能至少存在3种不同的生物学类型。