微小隐孢子虫亲环素型肽脯氨酰顺反异构酶基因克隆与分析

摘要：目的 克隆微小隐孢子虫（C.parvm）南京株( NJ) 亲环素型肽脯氨酰顺反异构酶基因,测序并分析C.parvumNJ株与其他隐孢子虫分离株CyP-type PPIase基因序列的差异以及亲缘关系。方法 根据GenBank上C.parvm Iowa II株CyP-type PPIase基因序列,设计2对引物,应用巢式PCR扩增目的基因,并将其克隆入pMD18-T载体,对重组子进行双酶切和菌落PCR鉴定并测序,应用生物信息学方法分析C.parvum NJ株CyP-type PPIase基因与其它隐孢子虫株的核苷酸和氨基酸序列差异。结果 巢式PCR扩增获得特异的目的基因,双酶切和菌落PCR鉴定获得正确的重组子,测序表明,扩增基因组DNA序列为746bp,含有目的基因ORF全长570bp,编码190个氨基酸,该基因已登录GenBank,登录号为JQ284432。序列分析表明,我国C.parvum NJ 株与国外分离的Iowa II 株CyP-type PPIase基因的氨基酸序列具有99%的同源性。进化树分析表明,C.parvm NJ株与Iowa II 株CyP-type PPIase基因之间的亲缘关系最近,与脑膜炎双球菌的亲缘关系最远。结论 成功克隆C.parvum CyP-type PPIase基因,C.parvum CyP-type PPIase基因在氨基酸水平具有高度保守。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌pgk基因的克隆与序列分析

目的获得牛乳腺炎无乳链球菌分离菌株pgk基因序列,分析其基因与氨基酸的同源性。方法参考Gen-Bank上公布的牛源无乳链球菌pgk基因序列设计合成1对引物,通过PCR扩增获得其序列并进行克隆与测序分析。结果所扩增的pgk基因序列的大小为1 197 bp,负责编码399个氨基酸残基。对比扩增的分离菌株pgk基因序列与GenBank上公布的B群无乳链球菌pgk基因（AE009948）相似性达到99.83%,编码的氨基酸序列相似性达到99.74%。结论该基因序列具有高度的保守性,为进一步对分离菌株的pgk基因进行高效表达及其产物的抗原性研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫LDH基因的克隆与序列分析

目的克隆微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,Cp)南京株(NJ)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因,测序并分析微小隐孢子虫NJ株CpLDH与其他隐孢子虫分离株LDH基因序列的差异。方法根据微小隐孢子虫已知LDH 基因序列设计合成2对引物, 应用巢式PCR 技术从微小隐孢子虫NJ株基因组DNA 中扩增LDH 基因, 并将其克隆到pMD18 T 载体上,阳性克隆的重组质粒经PCR及双酶切鉴定后, 用双脱氧链终止法对重组质粒中的插入序列进行测序,应用生物信息学方法分析 CpLDH 基因序列和其他物种LDH序列的同源性。结果巢式PCR 扩增得到特异的CpLDH 基因序列,经PCR及双酶切鉴定获得了正确的pMD18 T CpLDH 重组质粒。测序表明, NJ株微小隐孢子虫LDH 基因全长966 bp, 编码322个氨基酸,该基因序列已登录GenBank,登录号为 HM001298。序列分析表明, 我国微小隐孢子虫NJ株与国外分离的Iowa II株 LDH基因编码的氨基酸序列具有98%的同源性。结论成功克隆了微小隐孢子虫NJ株LDH 基因;序列测定及同源性分析表明, 微小隐孢子虫NJ株在LDH酶关键结构位点存在突变。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌临床分离株fbsA基因的克隆与序列分析

目的克隆并分析牛乳腺炎无乳链球菌内蒙古地区临床分离株表面蛋白fbsA基因核苷酸及编码氨基酸序列,预测其潜在的抗原表位。方法以无乳链球菌内蒙古地区临床分离株为材料,根据GenBank中公布的无乳链球菌fbsA基因序列设计特异性克隆引物,采用同源克隆法,PCR扩增fbsA基因序列,采用DNA Star生物信息学软件预测分析其编码氨基酸的潜在抗原性。结果克隆的fbsA基因序列大小为321bp,编码107个氨基酸残基,与GenBank中公布的B群无乳链球菌fbsA基因核苷酸序列同源性为98.13%,氨基酸序列同源性为99%。预测克隆基因编码氨基酸抗原性指数良好。结论成功克隆出内蒙古地区奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白fbsA基因序列,并预测其编码氨基酸具有潜在抗原性为进一步研究其原核表达产物的抗原性及致病机制奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

野生型产气荚膜梭菌β毒素基因的克隆与分析

用多联PCR方法对从猪舍污水中分离的细菌进行鉴定，获得1株B型和1株C型产气荚膜梭菌，用PCR方法扩增了β毒素基因并进行了测序，获得了包括RBS、信号肽基因和全长成熟肽基因以及部分3′末端序列的β毒素基因；测序后与GenBank中B、C型菌β毒素基因进行比较。野生B、C型菌与二者的同源性分别达到99％以上，氨基酸同源性也在99％以上。     

新城疫病毒TL1株NP基因的遗传变异研究

目的分析新城疫病毒TL1株NP基因部分序列,并与代表性毒株进行比较。方法根据GenBank登陆的新城疫病毒NP基因序列,设计了1对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的NP基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T easy载体,通过酶切、PCR和测序进行验证。结果测序拼接得出NP基因的序列长度为1 528 bp,该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489个氨基酸。与GenBank下载的14株参考毒株比较NP基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.5%,氨基酸的同源性为99.0%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为97.6%,氨基酸的同源性为99.2%,而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为85.7%,氨基酸的同源性91.6%。结论TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因Ⅶ型新城疫病毒,该毒株相对于经典的NDV在NP基因上已发生了较大的变异。     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

广东省布鲁氏菌分离株的分子特征分析

目的了解广东省布鲁氏菌分离株的分子特征。方法应用传统分型鉴定方法和PCR扩增布鲁氏菌属特异性基因BCSP31,对广东省历年布鲁氏菌分离株作鉴定分型,进一步采用脉冲场电泳技术(PFGE)进行分子分型,分析比较菌株分子指纹图谱的相似性,以探讨不同年份和地域菌株之间的相关性。结果1965年广东省布鲁氏菌分离株以羊种和猪种为主,1985年的分离株均为猪种3型,2006和2007年的分离株均为羊种3型;PFGE电泳图谱经聚类分析结果显示,历年布鲁氏菌分离株分成三大簇(Clusters):1965年羊种、1965年猪种与1985年猪种3型、2006年和2007年羊种3型。近两年珠三角地区布鲁氏菌病的流行优势菌型为羊种3型,且同源性达100%,但与1965年羊种分离株的同源性只有77.7%。结论近两年我省布鲁氏菌的优势菌型为羊种3型,各地区分离株之间的遗传关系高度相关,与20年前的分离株同源性差。PFGE可作为传统生物分型的补充手段,可在种的水平对布鲁氏菌分离株分型。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析，为H.pyiori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0．35kb的hspA基因片段，特异PCR可扩增出hspA基因片段，证实H.pylori hspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号：AY295084)，编码由118个氨基酸残基组成的肽链，hspA基因序列与GenBank公布的H.pylorl相应基因同源性高达95．20％～97．48％，氨基酸序列同源性在95．76％～97．46％之间。结论 克隆了H．pylori菌株MEL-HP27的hspA基因，其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97．48％。     

内蒙古布鲁氏菌临床分离株多位点序列分型研究

目的探讨临床分离布鲁氏菌的种群结构和遗传进化特征。方法布鲁氏菌标准参考菌株羊种16M,牛种544A和猪种1 330 S作为对照菌株,采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)方法对内蒙古地区分离的116株羊种布鲁氏菌进行分析,确定待测菌株的序列型(STs),用软件BioNumerics(Version 5.0)构建菌株的最小生成树。结果116株羊种布鲁氏菌全部为ST8型,9个MLST位点的变异完全相同,分离株种群结构单一;羊种菌的生物型与ST型无明显关联,ST8型菌系该地区的主要流行菌种,并与内蒙古地区先前分离羊种布鲁氏菌进化程度相同,且有密切的亲缘关系。结论羊种布鲁氏菌的序列分型(ST)与常规生物分型存在差异,ST8型菌可能具有较强的环境适应性和致病性。MLST是一种较好的羊布鲁氏菌种群和进化关系研究方法,但更适合于具有较大时间跨度和地理分布菌株间的流行病学调查。     

布氏菌分离株16SrDNA基因遗传进化分析

目的检测内蒙古布氏菌临床分离株的16SrDNA基因序列,构建16SrDNA遗传进化树,确定该菌株的分类地位。方法用BCSP31-PCR对临床分离株检测,再进行16SrDNA双向测序;从GeneBank下载标准参考菌株和与布氏菌有共同抗原细菌的16SrDNA基因序列;用Mega6.0进行序列比对并构建遗传进化树。结果BCSP31-PCR结果显示均有223 bp扩增条带,16SrDNA测序得到单一基因序列;比对后发现有4处特异片段,经Blast比对,位于844-1224包括380 bp的片段为布氏菌独有;进化树显示布氏菌临床分离株与标准菌株聚在1个末端分支上,遗传距离接近0,无法精细区分相互关系;与人苍白杆菌聚集在1个亚分支上,遗传距离0.019;与其它试验菌株如霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔菌遗传进化距离较远,遗传距离>0.02。结论从遗传进化角度对布氏菌分离株与标准菌株的亲缘关系进行分析,布氏菌所有种型遗传距离接近,提示布氏菌16SrDNA为高度保守序列,不宜做遗传进化分析的靶基因;布氏菌与人苍白杆菌有较近的亲缘关系;布氏菌属16SrDNA特有的380 bp的基因片段可作为布氏菌快速鉴定的靶序列。     

贵州省两株山羊源羊种布鲁菌MLST分析

目的了解贵州省2010年分离自山羊的两株羊种布鲁菌的等位基因序列型(Sequence type, ST)及遗传学特征,为动物间和人间布病疫情的预防和控制提供科学依据。方法应用布鲁菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)和种/型特异性PCR(AMOS-PCR)对2010年分离自山羊的两株布鲁菌进行鉴定,采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技术对两株布鲁菌菌株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,将各个基因的序列与参考菌株的等位基因型进行比对,确定其等位基因谱及序列型(STs),分析与两株菌ST型与各种型布鲁菌代表菌株的遗传进化关系。结果来自贵州省山羊的两株布鲁菌株经BCSP31-PCR鉴定为布鲁菌属细菌,AMOS-PCR将其鉴定为羊种布鲁菌。MLST分析显示,两株菌的9个等位基因序列型为ST8型,与同属羊种布鲁菌的ST7、ST9~ST12、ST34和ST35遗传关系最近。结论贵州省2010年分离的2株布鲁菌分离株均为ST8型布鲁菌,与同属羊种布鲁菌的ST型遗传关系最近,结果为贵州省人间和动物间布病疫情的预防和控制提供了科学依据。     

2018年江苏省人感染布鲁氏菌分离株分子特征分析

目的 掌握江苏省2018年人感染布鲁氏菌主要流行株的种型和基因型。方法 运用普通PCR及AMOS多重PCR确认分离株的生物种型;采用多位点序列分型(Multilocus sequence analysis, MLSA)和多位点串联重复序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)鉴定基因型,并与国内外流行株进行聚类分析。结果 2018年共分离到56株布鲁氏菌,MLSA分型显示一株菌为猪种布鲁氏菌ST (Sequence type)17型,其他均为羊种布鲁氏菌ST8型。MLVA将56株菌分为47个基因亚型(46个羊种,1个猪种),聚类显示羊种布鲁氏菌全部为“东地中海簇”。结论 2018年江苏省人感染布病主要为“东地中海簇”的ST8型羊种布鲁氏菌,并首次发现一例人感染ST17型猪种布鲁氏菌。     

陕西省布鲁氏菌菌株多位点序列分析研究

目的 对陕西省分离的77株布鲁氏菌菌株进行遗传多态性分析,了解其遗传特征及进化关系。方法 应用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)技术,测定77株陕西省地区布鲁氏菌分离株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列,确定各菌株序列型(STs),运用BioNumerics(Version 7.6)构建最小进化树,分析菌株间遗传进化关系。结果 74株分离株(47株羊种3型、10株羊种1型、7株羊种2型、10株羊种变异型)序列型为ST8型,2株分离株(牛种生物型)序列型为ST2,1株分离株(猪种1型)序列型为ST14型。结论 不同生物型布鲁氏菌的MLST分型结果稳定,羊种3型(ST8型)布鲁氏菌是陕西省主要流行菌株;MLST分型作为传统生物分型的技术补充,建立了陕西省布鲁氏菌基因分型数据库,对本省今后人间布病的防控具有科学指导意义。     

PCR-HRM方法快速鉴定布鲁氏菌的初步应用

目的 本研究旨在建立准确、快速地鉴定布鲁氏菌菌种及生物分型的PCR-HRM(高分辨率熔解曲线)方法。方法 根据目的基因序列,参考文献合成6对基因扩增引物(1对布鲁氏菌属特异引物,5对种间特异引物),应用PCR-HRM方法鉴定布鲁氏菌属6个种19个生物型的标准菌株,并初步应用到临床分离的35株布鲁氏菌中。结果 采用布鲁氏菌属特异引物(Bspp),6个种19个生物型的标准菌株均扩增出同样形状的溶解曲线,与其它对照菌株的曲线不同;采用5对种特异引物,6个种的标准菌株均有特征性PCR-HRM曲线;临床分离的35株布鲁氏菌的PCR-HRM曲线与羊种布鲁氏菌标准菌株的一致。结论 该研究采用的PCR-HRM分析方法,获得了布鲁氏菌属及6个种标准菌株的不同曲线图,可准确鉴定临床分离的羊种布鲁氏菌,可用于临床微生物实验室疑似布鲁氏菌感染的初步鉴定。     

2009-2012年宁夏人群感染布鲁氏菌种型分布特征

目的鉴定2009—2012年宁夏分离的布鲁氏菌,掌握感染人群的主要布鲁氏菌种型。方法采用血培养瓶从试管凝集试验（SAT）抗体阳性的病人血液中分离布鲁氏菌,利用传统生物学特性鉴定方法结合聚合酶链式反应（PCR）和A,M,O,S-聚合酶链式反应（AMOS-PCR）方法进行种型鉴定。结果从目标人群中共分离22株菌,PCR检测均扩增出223bp的特异性条带,鉴定为布鲁氏菌。AMOS-PCR中均扩增出178bp和731bp的特异性条带,鉴定为羊种布鲁氏菌,结合染料抑菌试验、噬菌体裂解和特异性血清凝集试验结果,22株菌均为羊种3型布鲁氏菌。结论2009—2012年宁夏人群感染布鲁氏菌主要为羊种3型布鲁氏菌,PCR和AMOS-PCR可作为布鲁氏菌分离鉴定的辅助方法推广使用。     

2011年龙岩市流行株柯萨奇病毒A组16型VPl基因特征分析

目的分析2011年龙岩市流行的柯萨奇病毒A组16（CVA16）分离株的分子生物学特征。方法对从龙岩市2011年散发的手足口病（HFMD）患者标本中分离CVA16病毒,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增VPl基因片段全长,并对扩增产物测序。根据VPl基因核苷酸序列与国内外其他CVA16毒株序列构建进化树,并进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果 4株龙岩分离株CVA16核苷酸同源性为99%~100%。比较推导的氨基酸序列,VP1不存在位点差异,氨基酸序列完全相同。对分离株病毒进行VP1核苷酸序列两两差异分析,与国内其他分离株VP1基因序列的一致性为87%~100%。确定4株CVA16病毒均属于B1b基因型。结论引起2011年龙岩市HFMD流行的CVA16病毒均为B1b基因型,与目前国内其他地区流行毒株高度同源。     

羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体制备与鉴定

目的 制备与鉴定羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体,用于布菌感染免疫机制研究。方法 将OMP19基因连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP19质粒,转化入大肠埃希氏菌BL21(E3),以不同浓度异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用镍金属螯合亲和层析(NI-NTA)纯化;以布菌阳性血清检测重组蛋白免疫反应性,并利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,以天然OMP19蛋白及布菌外膜蛋白提取物(NMP)对制备的单克隆抗体进行Western Blot及酶免疫染色试验(IEST)鉴定。结果 表达了OMP19蛋白,分子量约19 kDa,通过纯化纯度可达95%,Western Blot分析显示蛋白具有良好的抗原性,并制备了OMP19抗原23株鼠源性单克隆抗体,鉴定结果 显示22(95.65%)株能与天然OMP19蛋白反应,18(78.26%)株能与NMP反应,其中IgG1(k)亚型占91.30%;4株能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应。结论 成功制备具有良好抗原性的重组OMP19蛋白,筛选出识别天然蛋白的单克隆抗体,已初步应用于布菌的检测,为OMP19抗原B细胞表位的筛选奠定基础。     

左氧氟沙星体外诱导马耳他布鲁杆菌耐药后gyrA基因的变异

目的 探讨马耳他布鲁杆菌对喹诺酮类抗菌药物耐药性的产生机制,为指导临床合理用药提供依据.方法 使用左氧氟沙星分别对6株马耳他布鲁杆菌(Bru1、Bru2、Bru3、Bru4、Bru5、Bru6)进行体外耐药诱导并筛选耐药菌株.采用琼脂稀释法测定左氧氟沙星对6株马耳他布鲁杆菌及诱导耐药菌株的最低抑菌浓度(MIC),采用纸片扩散法(K-B法)测定6株马耳他布鲁杆菌和诱导耐药菌株对喹诺酮类抗菌药物(左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、氧氟沙星)的敏感性.应用PCR技术扩增6株马耳他布鲁杆菌及诱导耐药菌株的gyrA基因,并对获得的基因进行同源性分析及氨基酸序列推导.结果 左氧氟沙星对Bru1,Bru2,Bru3,Bru4,Bru6菌株MIC为0.50 μg/ml,对Bru5菌株为0.25 μg/ml,菌株Bru3、Bru4经左氧氟沙星诱导后转变成耐药菌株,分别命名为LEVR3及LEVR4,其MIC分别为64.00、128.00 μg/ml,与诱导前比较,增加了128倍和256倍,6株马耳他布鲁杆菌对上述喹诺酮类药物均敏感,2株诱导耐药菌株对上述喹诺酮类药物均耐药,并且其GyrA亚单位的喹诺酮耐药性决定区(Quinolone resistance-determing region,QRDR)发生突变:Ala87(GCU)置换为Val(GUU)、Asp91(GAU)置换为Gly(GGU).结论 马耳他布鲁杆菌可在左氧氟沙星短期作用后获得耐药性,诱导的耐药菌株gyrA基因发生突变,且对其他喹诺酮类药物产生交叉耐药.