我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析

目的了解我国部分省区分离的大肠埃希菌O157∶H7菌株特异基因和毒力基因携带特点及在不同动物宿主来源的菌株分布情况。方法采用PCR对分离菌株的O157、H7抗原特异基因rfbEO157、fliCH7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因进行检测。结果在1992-2006年收集的O157及H7抗原阳性的345株大肠埃希菌株中,rfbEO157、fliCH7特异基因均为阳性,eaeA和hlyA的阳性率分别为99.4%和99.1%,stx2的阳性率为91.9%,stx1阳性率仅为13.3%,stx1+stx2的阳性率为13.0%,来源于病人和动物菌株的stx2阳性率均高于stx1。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主。携带毒力基因的O157∶H7菌株在羊、牛等动物宿主中广泛存在。结论 stx2是病人及羊、牛等动物来源的产志贺毒素大肠埃希菌O157∶H7携带的主要毒素基因型。     

上海地区2006-2009年分离的大肠埃希菌O157特征分析研究

目的分析2006年至2009年在上海地区各监测点从病人、动物粪便及食品中分离的13株大肠埃希菌O157（E.coliO157）携带毒力基因的情况,分子分型特征及各菌株之间的相关性。方法利用聚合酶链反应（PCR）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,结合生化鉴定、血清学分型的表型分析方法及Vero细胞毒性试验对上海地区分离的13株E.coliO157进行研究。结果 PCR结果显示有9株菌株的菌体抗原基因O157,鞭毛抗原基因H7及毒力基因stx2,hly,eaeA检测结果均为阳性,其中1株食品分离株的stx1基因检测结果也为阳性;9株菌均对Vero细胞有毒性作用。其余4株牛粪分离株,除O157基因检测结果为阳性外,其他检测结果均为阴性。13株上海分离株可分成6个PFGE型别。其中1株食品分离株与同样带有stx1基因的德国分离株的图谱最为接近;2株腹泻病人分离株属于同一PFGE型别;6株牛粪分离株的PFGE型别相同或高度相似。其余4株不携带毒力基因的牛粪分离株为不相关菌株。结论上海地区从病人、动物粪便和食品中都分离获得了能产生stx毒素的E.coliO157,提示需加强对该菌的监测。     

多重PCR方法械检测EHEC和EPEC毒力基因

目的　建立简易实用的检测EHEC和EPEC多种毒力基因的方法。方法　应用多重PCR同时检测大肠埃希菌菌株的stx1、stx2、EPEC和EHEC共同的eaeA（eaeA-gen）等靶基因;用常规PCR检测EHECO157特异的eaeA（eaeA-O157）基因,以区分EHEC和EPEC的eaeA基因。结果　对分别分离自美国和我国江苏的EHECO157菌株以MPCR检测,stx1、stx2和eaeA-gen基因均阳性,同时常规PCR扩增eaeA-O157也阳性。在8株分离自杭州的志贺毒素阴性的大肠埃希菌O157菌株中,stx1、stx2和eaeA-O157基因均阴性,仅2株扩增出EPECeaeA基因。在28株EPEC血清型、12株ETEC血清型、12株EIEC血清型大肠埃希菌菌株中,stx1和stx2基因均阴性;3株EPEC血清型菌株eaeA-gen基因阳性。结论　MPCR技术可同时检测菌株的stx1、stx2和eaeA基因,可为EHEC和EPEC感染的诊断及流行病学调查,提供一种简便、实用、经济的技术手段。     

多重PCR方法检测EHEC和EPEC毒力基因

目的 建立简易实用的检测EHEC和EPEC多种毒力基因的方法。方法 应用多重PCR同时检测大肠埃希菌菌株的stx1、stx2、EPEC和EHEC共同的eaeA(eaeA-gen）等靶基因;用常规PCR检测EHEC O157特异的eaeA(eaeA-O157）基因,以区分EHEC和EPEC的eaeA基因。结果 对分别分离自美国和我国江苏的EHEC O157菌株以MPCR检测,stx1、stx2和eaeA-gen基因均阳性,同时常规PCR扩增eaeA-O157也阳性。在8株分离自杭州的志贺毒素阴性的大肠埃希菌O157菌株中,stx1、stx2和eaeA-O157基因均阴性,仅2株扩增出EPEC eaeA基因。在28株EPEC血清型、12株ETEC血清型、12株EIEC血清型大肠埃希菌菌株中,stx1和stx2基因均阴性;3株EPEC血清型菌株eaeA-gen基因阳性。结论 MPCR技术可同时检测菌株的stx1、stx2和eaeA基因,可为EHEC和EPEC感染的诊断及流行病学调查,提供一种简便、实用、经济的技术手段。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测。方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测。结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性。结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体。     

衢州市带毒力因子肠出血性大肠埃希菌O157：H7的检测

目的了解衢州市家禽、家畜肠出血性大肠埃希菌O157:H7带菌情况和菌型分布特征,以制定相应的防治对策。方法6月份肠道传染病高发季节,采集动物粪便标本,对O157:H7菌株进行分离培养,并用PCR方法检测其毒力基因。结果共采集动物粪便标本300份,检出O157:H7菌16株,总带菌率为5.33%,其中牛、羊、猪带菌率较高,分别为20.83%、12.70%和3.61%。经PCR检测,检出的所有菌株均携带SLT2毒力因子,而SLT1与hly阴性。结论衢州市分离到带有毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7,对人群健康构成了威胁,应加强O157:H7的综合监测。     

陕西省O157出血性大肠杆菌分布研究

目的了解陕西省家禽家畜O157大肠杆菌带菌和致病力情况以及市售食品的污染状况,分析对人群可能造成的威胁。方法根据我省不同地域选择监测点,采集监测点内养殖场或个体养殖户养殖的动物粪便1657份;集贸市场和超市销售的7类食品样品877份进行O157大肠杆菌监测,应用PCR技术对分离菌株进行毒力基因检测和流行病学分析。结果从动物粪便中分离出64株O157大肠杆菌,总带菌率3.86%,其中奶牛带菌率最高,达10.89%。从食品样品中分离出6株,总污染率0.68%。70株分离菌通过PCR检测发现,大多数O157大肠杆菌不携带H7鞭毛素fliCH7基因以及stx1、stx2、eaeA、hlyA4种毒力基因,含有fliCH7基因的9株菌则全部携带有stx2、eaeA、hlyA毒力基因,表现为fliCH7基因与已知毒力基因的相关性及分离菌株毒力基因图谱的一致性。结论陕西省猪、牛、鸡动物存在有O157大肠杆菌,并且食品已受到污染,所显示的毒力基因图谱单一,提示陕西省存在有O157大肠杆菌感染的威胁,有造成O157大肠杆菌流行或局部暴发流行的可能。     

徐州市大肠埃希菌0157：H7宿主动物带菌情况及毒力研究

目的了解徐州地区O157H7大肠杆菌宿主动物带菌情况及其毒力基因阳性率.方法采集流行区内猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本,用免疫磁珠法进行病原菌分离培养,并用多重引物PCR进行毒力基因分析.结果共采集猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本925份,检出O157H7大肠杆菌127株,检出率为13.73%.其中,以牛、羊检出率较高,分别为18.60%和16.01%.对42株菌株进行了SLT1、SLT2、eaeA和Hly四种毒力基因的检测,85.71%的菌株毒力基因阳性,且以同时带有SLT2、eaeA和Hly三种毒力基因最为常见,占带毒菌株的80.56%.病家分离的菌株带毒率(96.43%)明显高于外对照(64.29%)(P＜0.01).结论加强宿主动物O157H7监测,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义.     

福建省非典型肠致病性大肠杆菌（aEPEC）的发现及某些分子特征的研究

目的2010年10月从一名死婴粪便标本中分离到非典型肠致病性大肠杆菌（aEPEC）,为福建省首次鉴定该病原菌。本研究的目的是了解该病原菌的特征,为进一步开展aEPEC的研究工作提供基础数据。方法包括常规的系统生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验、PCR检测毒力基因分布、eaeA基因的测序分析。结果该菌株生化表现符合大肠埃希氏菌特征;现有的典型的EPEC血清型不能凝集;药敏实验结果提示对大部分的药物均敏感;毒力基因检测为eaeA+、bfp-、stx1-、stx2-、ehxA-、paa-;eaeA序列在NCBI上比对的结果均提示为大肠埃希氏菌（EHEC/EPEC）紧密素（intimin）的eaeA基因。结论根据常规实验、分子诊断及测序结果证实该病原菌为福建省首次鉴定的非典型肠致病性大肠杆菌（aEPEC）,同时我们需要进一步检测其它的毒力相关基因,探讨这些基因和该菌株致病力的关系。     

O157:H7型大肠埃希菌CRISPR结构及耐药基因和毒力基因分布分析

目的了解O157:H7型大肠埃希菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)结构特征以及耐药基因和毒力基因分布情况。方法利用多序列比对、BLAST、RNA二级结构预测等多种生物信息学方法对20株O157:H7型大肠埃希菌的全基因组序列进行分析。结果从GenBank数据库获得2000-2014年20株O157:H7型大肠埃希菌全基因组序列,所有基因组中共存在3个CRISPR位点且每个CRISPR位点的基因序列具有高度一致性(均超过99.7%);CRISPR2被一段序列分隔为CRISPR2a和CRISPR2b;CRISPR1中存在3个不同的间隔序列,CRISPR2也有3个不同的间隔序列,CRISPR3有1个间隔序列;CRISPR1和CRISPR3的重复序列均可形成茎环结构,CRISPR2和CRISPR1的重复序列具有较高的一致性。共检测7个耐药基因,所有菌株ampc均阳性,4株菌株tetB和sul1阳性,其它4个基因均未检出;共检测6个毒力基因,有10株细菌stx1阳性,其他5个毒力基因20株细菌均阳性。结论 CRISPR在O157:H7型大肠埃希菌中广泛分布且结构稳定,毒力基因分布广,耐药性问题不可忽视。     

动物源性肠出血性大肠杆菌O157︰H7及其三个毒力基因的多重PCR快速检测研究

目的 建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157︰H7及其三个主要毒力基因（hylA、eaeA和stx2基因）的多重PCR方法。方法 根据GenBank公布的大肠杆菌O157︰H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素（hlyA） 基因、紧密黏附素（eaeA）基因和志贺样毒素2 （stx2） 基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果 该方法扩增目的基因片段分别为327 bp、247 bp、494 bp、384 bp和779 bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104 cfu/mL。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7及其三个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157︰H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。     

我国部分地区猪源大肠杆菌LEE和HPI毒力岛相关基因的检测

目的 采用PCR方法检测我国江苏等9个省市部分地区分离的1007株猪源大肠杆菌中肠细胞脱落位点毒力岛（LEE）和强毒力岛（HPI）。方法 对LEE毒力岛检测其核心区的衙和eaeA基因，对HPI毒力岛检测其irp2和fyuA基因。同时对LEE和／或HPI阳性大肠杆菌进行了O血清型的鉴定。结果 在分离的猪源大肠杆菌中。LEE毒力岛基因检测结果为：2．2％（22／1007）的菌株let和eaeA基因的扩增阳性，0．5％（5／1007）的菌株eaeA阳性。HPI毒力岛基因检测结果为：10．6％（107／1007）的菌株irp2和fruA基因扩增阳性，2．1％（21／1007）的菌株irp2阳性；其中有2株irp2和ler基因扩增阳性，有3株irp2、ler和eaeA基因扩增阳性，1株irp2、fyuA、ler和eaeA基因扩增都为阳性；在128个HPI阳性分离株中，093和0107血清型菌株分别占定型菌株的15．7％（13／83）和12．0％（10／83）。结论 2．7％的猪源大肠杆菌携带LEE．12．7％的菌株携带耶尔森菌HPI，O93和O107为猪源HPI大肠杆菌常见血清型。     

O157大肠埃希菌食品分离株的特征研究

目的掌握福建省E.coliO157∶H7和O157∶H?食品分离株的毒力基因携带状况、PFGE分型特征、抗生素的药敏谱以及产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株的细胞毒性状况。方法分离菌株经VITEK全自动生化系统鉴定;O157和H7单克隆诊断血清凝集;PCR法检测O157、H7抗原基因及毒力因子基因;菌株的分型用PFGE方法进行;采用CLSI推荐的K-B法对菌株进行15种抗生素的药敏试验;对产志贺毒素的分离株用Vero细胞和Cyto Tox 96R○试剂盒进行细胞毒性检测。结果2株E.coliO157∶H7,其O157、H7及Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阳性,Stx1基因均阴性;另3株E.coliO157∶H?,其O157基因阳性,H7和Stx1、Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阴性;5株菌的PFGE带型各不相同,2株E.coliO157∶H7的同源性较高,达81%;菌株对15种常用抗生素较为敏感,链霉素、甲氧苄啶敏感率稍低为40%,其余敏感率达60%～100%。2株产志贺毒素的菌株对Vero细胞有毒性作用,细菌细胞比位50:1时细胞毒性百分比分别为61.25%和67.80%。结论本省在外环境动物性食品中存在产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株,提示应加强E.coliO157∶H7的监测,预防该菌在本省人间的感染和流行。     

徐州市大肠埃希菌O157:H7宿主动物带菌情况及毒力研究

目的　了解徐州地区O15 7∶H7大肠杆菌宿主动物带菌情况及其毒力基因阳性率。方法　采集流行区内猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本 ,用免疫磁珠法进行病原菌分离培养 ,并用多重引物PCR进行毒力基因分析。结果　共采集猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本 92 5份 ,检出O15 7∶H7大肠杆菌 12 7株 ,检出率为 13 73%。其中 ,以牛、羊检出率较高 ,分别为18 6 0 %和 16 0 1%。对 4 2株菌株进行了SLT1、SLT2、eaeA和Hly四种毒力基因的检测 ,85 71%的菌株毒力基因阳性 ,且以同时带有SLT2、eaeA和Hly三种毒力基因最为常见 ,占带毒菌株的 80 5 6 %。病家分离的菌株带毒率 (96 4 3% )明显高于外对照 (6 4 2 9% ) (P <0 0 1)。结论　加强宿主动物O15 7∶H7监测 ,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义。     

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测北大核心CSCD

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。     

牛源大肠杆菌O157∶H7分离与鉴定及其毒力基因检测

目的研究新疆肉牛主产区健康牛群中该菌的携带情况及致病的可能性。方法对采自新疆伊犁昭苏县某牛场健康牛的85份新鲜牛粪样本,增菌后用SMAC平板和MUG实验进行筛选,再用PCR技术和生化试验鉴定;对分离到的E.coli O157∶H7用PCR法检测其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因携带情况;用腹腔注射EC肉汤增菌原液的方法进行动物攻毒实验,确定分离菌株的致病性。结果 85份粪样中只鉴定出1株E.coli O157∶H7,检出率为1.176%;而这株菌同时携带被检测的5种毒力基因;攻毒实验所有的小白鼠于24h内全部死亡。结论新疆伊犁地区牛群携带有E.coli O157∶H7,从所分离到菌株所携带的毒力基因情况和对小白鼠攻毒实验结果发现,这株菌对人有很强的潜在致病性。     

大肠埃希菌O157:H7脂肪酸组分及DNA特征研究

目的探讨大肠埃希菌O157：H7脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征。方法用气相色谱（Gaschromatography，GC）及随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphyi cDNA，RAPD）对2株大肠埃希菌O157：H7和其他6株大肠埃希菌全细胞脂肪酸组分及DNA指纹图谱特征进行分析。结果大肠埃希菌O157：H7不仅含有15：0和17：0脂肪酸组分，不含或仅含微量14：02OH和19：0w8c脂肪酸，而且sum4和sum7脂肪酸峰值也明显高于其他菌株，DNA指纹谱也显示了其独有特征。结论大肠埃希菌O157：H7脂肪酸组分及相对含量和DNA指纹图谱特征与O26：H11及其他大肠埃希菌显著不同，与大肠埃希菌O26：H11等在遗传进化关系上存在一定距离。     

临床产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性分析及耐药基因和Ⅰ类整合子的检测

目的了解产超广谱B．内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性及相关耐药基因之间的关系。方法采用K—B琼脂扩散法检测临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对18种抗生素的耐药性,用PCR技术检测相关耐药基因和Ⅰ类整合子并用DNA序列分析确认其所产生基因型。结果检测菌株中ESBLs阳性56株,阳性率为44．4％。所有检测菌株对亚胺培南全部敏感;56株ESBLs阳性的菌株有44株扩增到TEM基因（78．6％）,SHV型阳性的有2株（3．6％）,CTX-M型阳性的有48株（85．7％）,OXA型阳性的有1株（1．79％）,intl1阳性菌株有35株（62．5％）,占未检出PER和VEB型。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs较高,耐药显著,碳青霉烯类抗生素是目前治疗产ESBLs细菌最有效的药物;TEM型和CTX-M型ESBLs为我院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的主要基因型,携带Ⅰ类整合子基因是导致细菌产ESBLs的重要原因。     

长治地区腹泻患者致泻性大肠杆菌的检测与分析

目的 了解山西省长治地区感染性腹泻患者致泻性大肠杆菌分离情况及菌株特征。方法 收集腹泻患者粪便,EC肉汤增菌后,采用针对致泻性大肠杆菌7个毒力基因eaeA、aggR、ipaH、stx1、stx2、lt、stIb及16S rRNA基因rrs的多重PCR初筛后,阳性者作致泻性大肠杆菌分离,再对分离菌株行生化鉴定、毒力基因检测及血清群测定。结果 170份标本中分离到致泻性大肠杆菌20株,阳性率为12%。其中EPEC 11株,均为非典型EPEC,EAEC 7株,ETEC 2株。结论 长治地区致泻性大肠杆菌感染以5岁以下儿童为主,除EPEC外,EAEC占有很大比例;对致泻性大肠杆菌的检测及判断有赖于血清群与毒力基因检测的分子生物学方法相结合。