珠江河口水体霍乱弧菌监测及菌株毒力基因分布特征

目的 了解珠江河口水体中O1群和O139群霍乱弧菌的分布状况,分析菌株的分子特征和毒力基因特征.方法 对2009年1月至2010年12月从珠江河口水体中分离的59株O1群和10株O139群霍乱弧菌,采用聚合酶链反应(PCR)方法体外检测ctxA、tcpA、ace、zot、tcpl,hlyA、toxR和ompU等毒力相关基因,并进行毒力相关基因分型分析,对限制性内切酶Not Ⅰ消化后的基因组DNA进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,采用BioNumerics软件分析图谱,得到菌株带型相似性的聚类分析树状图.结果 2009-2010年共采集1 152份水体标本,分离得到O1/O139群霍乱弧菌69株,其中O1群埃尔托霍乱弧菌59株(小川型18株,稻叶型41株),O139群霍乱弧菌10株.PCR检测69株菌ctxA全部阴性,hlyA和toxR全部阳性,基因分型可分成9个型.稻叶型菌株中,34.15％(14/41)为hlyA+ toxR+ ompU+ ace+ zot+ tcpⅠ+型;小川型菌株中,66.67％(12/18)为hlyA+toxR+型;O139群菌株中,70％(7/10)为hlyA+ toxR+型.PFGE分型发现,O139群菌株PFGE相似度为69.9％～ 95.5％;O1群菌株相似度为72.8％～ 100.0％,可分成3个聚类.结论 在霍乱流行间歇期,该地区外环境水体中O1群和O139群霍乱弧菌非产毒株广泛存在,基因型别多样.     

烟台地区非O1/O139群霍乱弧菌致病性分析

目的了解烟台地区非O1/O139群霍乱弧菌致病性现状。方法分别于2020年7月和11月、2021年的1月和4月对烟台市某两条河入海口采集样本32份, 获得22株非O1/O139群霍乱弧菌分离菌株, 采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离菌株进行分子分型, 采用聚合酶链式反应(PCR)方法对该22株分离菌株的毒力基因ctxA、ctxB、ace、cep、zot、rtxA、hlyA、toxR、tcpA和cri进行检测分析。结果 22株非O1/O139群霍乱弧菌菌株间的条带相似度为23.0%～100.0%, 分为17个PFGE型, 呈高度的多态性带型分布。22株非O1/O139群霍乱弧菌分离株主要携带3种毒力基因(rtxA、tcpA和zot), 其中携带rtxA和tcpA最多, 均为17株, 其次是zot, 共14株。14株菌株同时携带rtxA、tcpA和zot, 5株不携带上述毒力基因。结论烟台地区入海口流行的非O1/O139群霍乱弧菌株污染情况多样化, 主要携带具有黏附、毒素以及损伤小肠表皮细胞等方面的致病基因。     

5株O139群霍乱弧菌生物学性状研究

目的研究从病人和水产品中分离到的5株O139群霍乱弧菌的生物学性状。方法参照《霍乱防治手册》对5株菌的生长特征、生化特征、血清学反应及药物敏感性进行鉴定；应用多重PCR方法对所试菌株进行毒力相关基因检测，用Vero细胞测定方法检测ctxA阳性菌株霍乱肠毒素的表达。结果5株O139群霍乱弧菌生物学性状和血清学反应与阳性对照菌体O139群霍乱弧菌MO45基本相同；2株来自重型病人和1株来自水产品的菌株ctxA、zot、ace、tcpA、tcpI、hlyA、rtxA、rtxC、ompU、tarR 11种毒力相关基因全部阳性。经Vero细胞测定，其霍乱肠毒素效价达到1：160；在2株来自轻型病人的菌株中仅hlyA、rtxA、rtxC、toxR 4种毒力相关基因为阳性。结论O139群霍乱弧菌致病(泻)的决定基因簇并非仅为ctxA、zot、ace、cep等毒力相关基因。     

武汉市霍乱弧菌中毒力相关基因及分类鉴定

目的为了解武汉地区历年收集的霍乱弧菌毒力相关基因分布情况,并对这些菌株进行分类鉴定。方法分别对霍乱弧菌中的ctxA、zot、ace、ompU、tcpA、toxR、tcpI与hlyA等基因进行PCR检测,并对所有霍乱弧菌进行PCR分类鉴定。结果分离的大部分霍乱弧菌菌株携带有所有的毒力基因,有3株细菌仅有个别非核心毒力基因扩增阳性;该PCR方法分类对O1型所有菌株都能很好地进行分类鉴别,对O139型则与血清型鉴定存在不一致情况。结论PCR方法对产毒型和非产毒型O1/O139霍乱弧菌以及O1/O139和非O1/O139霍乱弧菌鉴定效率非常好。     

嘉兴市霍乱弧菌分离株检测分析

目的比较分析嘉兴市霍乱弧菌菌株的血清型、毒力基因和分子分型特征。方法采用血清学和分子生物学方法对近年来分离到13株霍乱弧菌菌株进行血清型分布、毒力基因(ctxA、ace、zot、tcpA、cri和rtxA)携带和ERIC-PCR分型研究。结果 13株霍乱弧菌菌株,2株为O139群霍乱弧菌,11株为O1群霍乱弧菌,其中小川型9株,稻叶型2株。2株O139群霍乱弧菌菌株携带3种毒力基因;11株O1群霍乱弧菌菌株,除1株携带4种毒力基因外,其余10株携带全部6种毒力基因。ERIC-PCR分型分析显示,不同的霍乱弧菌菌株之间ERIC-PCR型别表现出一定的遗传多样性。结论嘉兴市霍乱弧菌菌株大多携带多种毒力基因,而且来源多样,防控工作任重而道远。     

非O1/非O139群霍乱弧菌感染病例分离株分子流行病学分析

目的 分析安徽省马鞍山市连续2个月内监测到的6例具有霍乱疑似症状、感染非O1/非O139群霍乱弧菌的病例,判断疫情的聚集性.方法 对病例分离株进行生化和血清型别鉴定以及溶血试验,药敏试验检测抗生素耐药谱,应用荧光PCR和常规PCR进行霍乱弧菌特异基因、毒力及其相关基因的检测,包括ompW、ctx 、tcpA、toxR、hlyA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析其分子型别.结果 生化鉴定和血清学试验鉴别腹泻病例6株菌株为非O1/非O139霍乱弧菌,均产生β溶血;14种药物中有12种属于全部敏感;荧光PCR检测霍乱弧菌特异性基因ompW均为阳性,ctx、tcpA 、zot、ace、rstR和gⅢCTX基因均为阴性,toxR 、hlyA基因有5株菌扩增阳性,1株菌(1001434446)为阴性;PFGE显示6株菌带型均不相同,但有2株非常相似,分离株与霍乱弧菌产毒株相似性很低.结论 6例感染非产毒的非O1/非O139群霍乱弧菌病例发病虽相对集中,但属于散发病例,在局部地区频繁出现,提示其公共卫生意义不可忽视.     

O1群和O139群霍乱弧菌致病性的比较研究

目的:比较O1群和O139群霍乱弧菌的致病性。方法:对O1群霍乱弧菌Eltor型小川1b型3株和稻叶1d型3株,及O139群霍乱弧菌6株,从酸敏感性、肠粘膜粘附、产肠毒素及相关基因等方面对两群菌株的致病性做以比较。结果:O1群和O139群霍乱弧菌的酸敏感范围为pH3.05～4.60;平均肠粘膜吸附菌数分别为4.04×106和3.58×106cfu/cm2;兔肠段积液平均分别为1.85和1.80ml/cm;兔红细胞凝集效价分别为1∶128和1∶64;12株霍乱弧菌都携带有ctxA、zot、ace、tcpA基因。结论:O1群和O139群霍乱弧菌的致病性是一致的。     

广东省2011—2013年腹泻病例非O1/O139群霍乱弧菌耐药性及分子特征

目的分析2011—2013年广东省腹泻病例非O1/O139群霍乱弧菌的耐药性及分子特征,为霍乱防控提供依据。方法选取2011—2013年广东省腹泻病例非O1/O139群霍乱弧菌分离株20株,以及同时期海水产品分离株4株,采用抗菌药物敏感试验、毒力基因PCR检测和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型方法,分析其耐药性及分子特征。结果抗菌药物敏感性试验结果显示,分离株对复方新诺明、萘啶酸和四环素的耐药率分别为70.8%(17/24),37.5%(9/24)和20.8%(5/24);对头孢曲松和阿米卡星则完全敏感。毒力基因PCR检测结果显示,所有的菌株均携带hly A和toxR基因,而所有菌株均未检出ctxA、tcp A、ace、zot、st等5种毒力基因。菌株经NotⅠ酶切后的PFGE型别表现出明显的多样性,病例菌株与海水产品分离株的带型差别较大。结论广东省非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因和遗传特征复杂多样,菌株对多种抗菌药物高度耐药,耐药率较高,需加强腹泻病例中非O1/O139群霍乱弧菌的菌株型别变异及耐药监测。     

杭州市O139群霍乱弧菌耐药变迁及毒力基因携带

目的 研究杭州市1994～2003年分离的O139群霍乱弧菌耐药性变迁以及携带ctxA、tcpA毒力基因的情况。方法 运用K—B法和PCR，检测90株O139群霍乱弧菌对抗生索的敏感性以及是否携带ctxA、tcpA毒力基因。结果 90株O139群霍乱弧菌中无丁胺卡那耐药的菌株，13株对诺氟沙星和环丙沙星耐药；对氨苄青霉索、复方新诺明分别有5年和6年的耐药率为100％；2002、2003年耐药谱增加到7种。87．87％的O139群霍乱弧菌同时携带ctxA、tepA毒力基因。结论10年来分离自杭州的O139群霍乱弧菌的耐药情况日益严重；O139群霍乱弧菌是否携带ctxA、tcpA毒力基因在对抗生素敏感性方面差异有统计学意义。     

广东省2009－2013 年霍乱弧菌病原学特征分析

目的 分析广东省2009－2013 年霍乱病例及环境来源O1/O139 群霍乱弧菌病原学特征。方法 选取2009－2013 年广东省霍乱病例来源、环境（水体和海水产品）来源的O1/O139群霍乱弧菌。采用血清分型、抗菌药物敏感性试验、毒力基因PCR 检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型方法 , 研究不同来源的霍乱弧菌血清型、抗菌药物敏感性、毒力基因携带以及分子分型方面的异同。结果 2009－2013 年广东省共分离得到各类来源O1/O139 群霍乱弧菌190株（病例16 株, 外环境174 株）。病例来源菌株分为O1 群稻叶型（3 株）、小川型（7 株）和O139 群（6株）3 种菌型;其中10 株ctxA 基因阳性, 2 株小川型菌株携带不完整CTXΦ噬菌体;5 株菌对11 种抗菌药物完全敏感, 3 株对4 种抗菌药物表现出耐受。外环境来源菌株中53 株稻叶型, 22 株小川型和2 株O139 群菌株携带不完整CTXΦ噬菌体;2 株O139 菌株检出ctxA 基因阳性;25 株对≥4 种抗菌药物耐受, 其中有2 株同时对11 种抗菌药物中的7 种耐受, 以水产品中的稻叶型菌株为主（13株）。PFGE分子分型结果显示, 菌株经NotⅠ酶切后的PFGE型别表现出明显的多样性。稻叶型和O139 群病例菌株的带型聚集在同一个聚类中, 小川型病例菌株带型分散在不同的聚类中, 病例来源菌株与环境来源菌株的带型差别较大。结论 广东省O1/O139 群霍乱弧菌毒力基因和遗传特征复杂多样, 菌株多重耐药形势严峻, 需要加强菌株型别变异及耐药监测。     

多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因

目的 探索建立一种快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1／非O139群的毒素相关基因的方法。方法 针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(oce)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)分别设计引物，建立多基因PCR方法；通过一次扩增反应之产物经琼脂糖凝胶电泳，可检测出菌株的毒素相关基因的携带情况。结果 阳性对照菌株：MO45(霍乱弧菌O139群)检出5种毒素相关基因，结果符合设计要求；其他不同来源的霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1／非O139群)检出1—5种不等的毒素相关基因；根据毒素相关基因携带情况，可将菌株分为5个基因型，并可区分为产毒株和非产毒株；多重PCR敏感度可达10^2cfu／ml。结论 该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

Phenotypic and genetic analyses of 111 clinical and environmental O1, O139, and non-O1/O139 Vibrio cholerae strains from different geographical areas

A total of 111 clinical and environmental O1, O139 and non-O1/O139 Vibrio cholerae strains isolated between 1978 and 2008 from different geographical areas were typed using a combination of methods: antibiotic susceptibility, biochemical test, serogroup, serotype, biotype, sequences containing variable numbers of tandem repeats (VNTRs) and virulence genes ctxA and tcpA amplification. As a result of the performed typing work, the strains were organized into four clusters: cluster A1 included clinical O1 Ogawa and O139 serogroup strains (ctxA(+) and tcpA(+)); cluster A2 included clinical non-O1/O139 strains (ctxA(-) and tcpA(-)), as well as environmental O1 Inaba and non-O1/O139 strains (ctxA(-) and tcpA(-)/tcpA(+)); cluster B1 contained two clinical O1 strains and environmental non-O1/O139 strains (ctxA(-) and tcpA(+)/tcpA(-)); cluster B2 contained clinical O1 Inaba and Ogawa strains (ctxA(+) and tcpA(+)). The results of this work illustrate the advantage of combining several typing methods to discriminate between clinical and environmental V. cholerae strains.     

Molecular identification of pathogenicity genes and ERIC types in Vibrio cholerae O1 epidemic strains from Mozambique

The phenotypic and genotypic profiles of the V. cholerae strains causing the Mozambican 1997-8 epidemic were characterized to provide a reference for comparison with other epidemic strains. A total of 75 strains of V. cholerae O1 isolated in different provinces, were analysed. Strains were characterized by PCR for detecting toxin genes (ctxA, zot and ace), virulence associated genes (tcpA. nanH, hlyA and torR) and ERIC sequences. All V. cholerae strains were serotype O1, Ogawa, biotype El Tor. MIC testing showed a high proportion of strains multi-resistant to drugs (100% to cotrimoxazole and 52% to tetracycline) and susceptibility to ciprofloxacin. The isolates contained two intact copies of the CTX genetic element and all other genes tested. PCR of restricted DNA revealed two ERIC types: the first in provincial isolates, also predominant in other African epidemic strains, and the second in Maputo isolates (the national capital).     

Ｏ１群霍乱弧菌毒力基因和菌株流行能力关系研究

摘要：目的　调查福建省１９６２－２００５ 年不同流行时期、不同流行血清型的Ｏ１ 群埃尔托型霍乱弧菌
（ＥＶＣ）毒力基因分布情况;探讨霍乱弧菌（ＶＣ）不同毒力基因特征与霍乱流行能力的关系。方法　运用
ＰＣＲ 扩增技术,检测１９６２－２００５ 年６９ 株（稻叶２１、小川４８） 霍乱患者分离株的犮狋狓犃基因, 同时进行
犮狋狓犅、狋犮狆犃、狉狊狋犚、犺犾狔犃毒力因子的古典型（犆犾）和埃尔托型（犈犾）基因亚型的扩增;结合流行病学资料
分析不同毒力特征菌株的流行能力。结果　６９株Ｏ１群霍乱弧菌犮狋狓犃基因阳性６２株,犮狋狓犃基因阴性的菌
株均不同程度地携带有其他各相关毒力基因;各毒力因子古典型和埃尔托型的阳检率分别为犮狋狓犅６０．９％
（４２株）和７２．５％ （５０株）,狉狊狋犚３７．７％ （２６株）和７２．５％ （５０株）,狋犮狆犃４．３５％ （３株）和６９．５７％ （４８
株）,犺犾狔犃６５．２２％ （４５株）和７９．７１％ （５５株）。犮狋狓犅 犆犾、狉狊狋犚 犆犾基因以及菌株同时携带狉狊狋犚 犆犾和狉狊狋犚
犈犾基因的阳性率在稻叶型（阳性率分别为３８．１％ 、０ 和０） 和小川型（阳性率分别为７０．８％ 、５４．２％ 和
３５．４％ ）菌株中的差异有统计学意义（犘均＜０．０５）。犮狋狓犅 犈犾、狉狊狋犚 犆犾、狉狊狋犚 犈犾基因的阳性率在１９６２－
１９６４年、１９７８ 年、１９９４－２０００ 年的小川型３ 个不同流行时期（阳性率分别为犮狋狓犅 犈犾：１００．０％ 、
１００．０％ 、４４．８％ ;狉狊狋犚 犆犾：０、０、８９．７％ ;狉狊狋犚 犈犾：１００．０％ 、８７．５％ 、５８．６％ ） 的差异有统计学意义
（犘均＜０．０５）。犮狋狓犅 犆犾、犮狋狓犅 犈犾、狉狊狋犚 犈犾基因的阳性率在１９８０－１９８６ 年、２００５ 年稻叶型两个不同流行
时期（阳性率分别为犮狋狓犅 犆犾：１３．３％ 、１００．０％ ;犮狋狓犅 犈犾：１００．０％ 、６６．７％ ;狉狊狋犚 犈犾：９３．３％ 、５０．０％ ）
的差异有统计学意义（犘均＜０．０５）。结论　福建省１９６２－２００５年Ｏ１群霍乱菌株不同程度地携带有相关的
毒力因子;各毒力因子埃尔托型基因片段的检出率均要高于古典型,以狉狊狋犚和狋犮狆犃基因的差异最明显;
相对于稻叶血清型,小川血清型更容易整合古典型的犮狋狓犅和狉狊狋犚基因片段;犮狋狓犅和狉狊狋犚基因的类型和不
同血清型霍乱菌株的流行能力有相关性。
关键词：霍乱弧菌;毒力基因;ＰＣＲ;等位基因
中图分类号：Ｒ１８３．４　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０１ ００４１ ０５     

Detection of virulence associated genes, haemolysin and protease amongst Vibrio cholerae isolated in Malaysia

Eighty-four strains of Vibrio cholerae O1, O139 and non-O1/non-O139 from clinical and environmental sources were investigated for the presence of the toxin co-regulated pilus gene, tcpA, the virulence cassette genes ctxA, zot, ace and cep and also for their ability to elaborate haemolysin and protease. The ctxA and zot genes were detected using DNA-DNA hybridization while the ace, cep and tcpA genes were detected using PCR. Production of haemolysin and protease was detected using mammalian erythrocytes and an agar diffusion assay respectively. Analysis of their virulence profiles showed six different groups designated Type I to Type VI and the major distinguishing factor among these profiles was in the in vitro production of haemolysin and/or protease. Clinical O1, O139 and environmental O1 strains were similar with regard to presence of the virulence cassette genes. All environmental O1 strains with the exception of one were found to possess ctxA, zot and ace giving rise to the probability that these strains may actually be of clinical origin. One strain which had only cep but none of the toxin genes may be a true environmental isolate. The virulence cassette and colonization factor genes were absent in all non-O1/non-O139 environmental strains but production of both the haemolysin and protease was present, indicating that these may be putative virulence factors. These findings suggest that with regard to its pathogenic potential, only strains of the O1 and O139 serogroup that possess the tcpA gene which encodes the phage receptor, have the potential to acquire the CTX genetic element and become choleragenic.     

2001至2005年广州地区霍乱弧菌主要致病相关基因特征分析

目的 应用多重聚合酶链反应（PCR）检测方法和测序研究近5年广州地区分离的霍乱弧菌的4种致病相关基因的携带情况及霍乱肠毒素基因ctxA的变异情况。方法针对霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）、小带联结毒素基因（zot）、辅助霍乱肠毒素基因（ace）、毒素共调菌毛亚单位A基因（tcpA）设计引物,将多重PCR方法应用于广州地区分离的276株霍乱弧菌的致病相关基因的检测。对ctxA基因的PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,探讨ctxA扩增产物的同源性。结果 近5年广州地区分离的276株霍乱弧菌中,人源株中93．9％为致病相关基因A型（ctxA^＋tcpA^＋ace^＋zot^＋型）菌,其余6．1％为致病相关基因C型（ctxA^-tcpA^-ace^-zot^-型）菌,临床分离的致病相关基因A型菌分离自轻、中、重型病例和带菌者,其中有68．5％分离自轻型病例,21．9％分离自带菌者,临床分离的致病相关基因C型菌中有63．6％分离自轻型病例,36．4％分离自带菌者,C型菌引起带菌者的比例高于A型菌;78株环境分离株中9．0％为致病相关基因A型菌,35．9％为致病相关基因B型（ctxA^-tcpA^-ace^＋zot^＋型）菌,55．1％为致病相关基因C型菌。霍乱肠毒素基因ctxA变异较小。结论 多重PCR方法揭示了广州地区霍乱弧菌致病相关基因模式的多态性,为深入研究人源和环境来源霍乱菌株致病相关基因的演化提供了有效手段,并对本地区霍乱的预防、控制和预警具有重要的指导意义。     

江西省239株霍乱弧菌毒力相关基因分布特征

摘要:目的　对江西省2000-2011年分离的霍乱弧菌进行毒力相关基因检测,在分子水平上了解霍乱弧菌毒力基因的分布特点以及流行和变迁规律。方法　采用PCR方法对239株霍乱弧菌进行ctxA、ace、zot、tcpA、rtxA 和 cri 基因检测。结果　在239株霍乱弧菌中,共表现出15种毒力基因携带类型,其中病例分离株,带菌者和环境调查分离株分别有7种,6种和3种基因携带类型,以6种基因全部携带为主,携带率分别为76.09%（35/46）,81.82%（27/33）,83.33%（20/24）,而外环境霍乱监测中霍乱弧菌毒力基因携带则有13种毒力基因携带型,呈现多样性。结论　霍乱弧菌中6种毒力基因的携带情况呈现多态性,病例相关分离株的毒力基因携带率高于外环境监测分离株。     

1984-2002年重庆市59株O_1群霍乱临床分离株耐药性及分子分型研究

目的分析重庆市1984-2002年O1群霍乱临床分离株的耐药性和菌株的相关性。方法对59株O1群霍乱临床分离株(小川型20株,稻叶型39株)采用K-B法检测对16种抗菌药物的敏感性,用NotI酶切基因组DNA,经脉冲场凝胶电泳(PFGE)获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果重庆地区O1群霍乱弧菌对复方新诺明耐药、痢特灵和链霉素的耐药严重,耐药率分别为28.81%(17/59)、61.02%(36/59)和30.51%(18/59),人群分离株对丁胺卡那、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、新霉素和强力霉素敏感,未发现耐药菌株。21株小川型和40株稻叶型O1群霍乱弧菌被分为13种PFGE型18个亚型,从患者分离到的59株O1群霍乱弧菌的相似性值约在88%～100%。结论未发现重庆市O1群霍乱弧菌人群分离株的耐药性有明显改变,小川型和稻叶型的耐药性不同。重庆市O1群霍乱弧菌人群分离株同源性较高,可能为来自同一来源的流行菌株。