骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞分化过程中的表达及对破骨细胞形成的影响

摘 要 背景 骨保护素和骨保护素配体在骨代谢过程中具有重要作用。本实验研究骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化过程中的表达情况,及对破骨细胞形成的影响,探讨其在骨代谢过程中的调节作用。 方法 采用梯度离心法获得人骨髓基质细胞,并将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法,确定骨髓基质细胞的功能状态和分化程度。采用RT-PCR和Western blot方法,检测骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中骨保护素和骨保护素配体的表达情况。在进一步的实验中采用骨髓法获得破骨细胞前体细胞,与分化中或者未分化的骨髓基质细胞共同培养,并加入OPG和OPGL进行实验,观察抗酒石酸阳性多核的破骨细胞形成情况。 结果 获得的骨髓基质细胞生长状态良好,生化指标稳定。骨髓基质细胞分化后,碱性磷酸酶分泌明显增加,可以产生大量的矿化结节,具有成熟成骨细胞的表型特征。RT-PCR和Western blot检测结果显示,在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,骨保护素在mRNA和蛋白质水平的表达明显升高,而骨保护素配体的表达则逐渐下降。细胞中OPG mRNA和蛋白质表达水平在第21天时达到最大,约为未分化时水平的2.5倍左右,而OPGLmRNA和蛋白质表达减少约为未分化时1/2。统计学分析,P<0.01,差异有显著性。实验结果显示破骨前体细胞与未分化骨髓基质细胞共同培养后,可以观察到TRAP阳性的多核破骨细胞形成,而与分化骨髓基质细胞共同培养后,不能检测到TRAP阳性多核破骨细胞的形成。但加入OPGL试剂后可以看到破骨细胞的形成。 结论 在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,骨保护素表达逐渐升高而骨保护素配体表达显著降低,两者比值逐渐增大,骨形成增加,并进一步抑制破骨细胞形成,减少骨吸收,这可能是调节MSC分化,OB和OC形成,使骨代谢周期平衡有序进行的重要机制。     

骨保护素及其配体在牙正畸中作用的研究进展

骨保护素(OPG)是生理性的抑制破骨细胞性骨吸收的因子,而骨保护素配体(OPGL)是能直接诱导破骨细胞分化发育并参与破骨细胞功能调节的细胞因子。牙周膜细胞可表达OPG和OPGL,揭示了在正畸牙移动中,牙周膜细胞可能是通过OPG/OPGL系统来调节牙槽骨代谢的。OPG和OPGL在多种骨病和牙正畸的治疗中具有很大潜力,具有良好的临床应用前景。     

阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞护骨素及护骨素配体mRNA表达的影响

目的：研究阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL表达的影响，探讨阿胶强骨胶囊治疗骨质疏松的分子机制。方法：3月龄wistar（雌雄各半）30只，随机分为阿胶强骨口服液，雌激素，及生理盐水对照组，灌胃7d后，制备实验组和对照组的含药血清。将新生SD大鼠分离的颅骨成骨细胞，制成单细胞悬液，消化传代，取二代培养的成骨细胞，制成细胞悬液。培养细胞分为5组，分别加同体积药液，对照组仅加培养液，继续培养。采用MTT比色分析法、3H-胸腺嘧啶核苷（3H—TdR）渗入法测定成骨细胞增殖，用放免法测定细胞内BGP含量，RT—PCR测定胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL mRNA的表达。蛄果：阿胶强骨口服液含药血清以剂量依赖方式促进成骨细胞的增殖，与对照组相比，差异显著（P〈0．05）。成骨细胞OPG基因mRNA表达在阿胶强骨口服液含药血清1000ml／L时最强，与雌激素组比较无显著性差异（P〉0．05），且明显高于对照组（P〈0．05）。成骨细胞RANKL基因mRNA表达在1000ml／L阿胶强骨口服液含药血清与雌激素组比较无显著性差异（P〉005），且明显低于对照组（P〈0．05）。结论：阿胶强骨口服液可在细胞水平上促进骨的合成代谢及前成骨细胞的有丝分裂，分子水平上调节OPG／RANKL表达而治疗骨质疏松。     

骨保护素基因敲除对小鼠左心室收缩功能的影响

目的 探讨左心室收缩功能与骨保护素配体(RANKL)和雌激素在骨保护素(OPG)基因敲除小鼠引起骨质疏松之间的关系.方法 建立OPG基因敲除小鼠模型,并设对照组;ELISA法检测小鼠血清 OPG 和RANKL水平,放射免疫法检测血清雌激素水平;利用心脏超声对心功能进行评价.结果 与对照组比较,OPG基因敲除组小鼠的心脏质量、心脏质量与体质量的比值、左室心肌细胞的横切面积均明显增大(P<0.01),左心室收缩末期内径和左心室收缩末期容积也明显增大(P<0.05).OPG基因敲除组小鼠血清RANKL浓度明显高于对照组(P<0.001),两组血清雌激素水平则无显著差异(P>0.05).结论 OPG缺乏导致血清RANKL水平升高,左心室心肌细胞肥大,但不影响血清雌激素水平.     

骨保护素基因敲除对小鼠左心室收缩功能的影响

目的探讨左心室收缩功能与骨保护素配体(RANKL)和雌激素在骨保护素(OPG)基因敲除小鼠引起骨质疏松之间的关系。方法建立OPG基因敲除小鼠模型,并设对照组;ELISA法检测小鼠血清OPG和RANKL水平,放射免疫法检测血清雌激素水平;利用心脏超声对心功能进行评价。结果与对照组比较,OPG基因敲除组小鼠的心脏质量、心脏质量与体质量的比值、左室心肌细胞的横切面积均明显增大(P<0.01),左心室收缩末期内径和左心室收缩末期容积也明显增大(P<0.05)。OPG基因敲除组小鼠血清RANKL浓度明显高于对照组(P<0.001),两组血清雌激素水平则无显著差异(P>0.05)。结论OPG缺乏导致血清RANKL水平升高,左心室心肌细胞肥大,但不影响血清雌激素水平。     

骨保护素系统对骨代谢的影响

破骨细胞(osteoclast,OC)的骨吸收与成骨细胞(Osteoblast,OB)的骨形成的平衡与协调是维持骨不断更新,功能正常和结构完整的关键。任何引起OC生成增多或过度活化的因素均可使OC功能亢进,骨吸收超过骨形成,导致代谢性骨病(如骨质疏松症)。抑制骨吸收已成为防治各种代谢性骨病的     

再生颗粒对兔股骨头坏死骨保护素和骨保护素配体mRNA表达影响的实验研究

目的:研究再生颗粒对兔股骨头坏死骨保护素和骨保护素配体mRNA表达水平的影响。方法:选用肌注甲强龙20mg/(kg.d),2次/周,连续注射4周制造兔股骨头坏死模型,再生颗粒治疗4周、8周后实时定量PCR检测骨保护素和骨保护素配体mRNA的表达情况。结果:再生颗粒治疗组在各时间点骨保护素的表达水平明显高于对照组,而骨保护素配体的表达明显低于对照组。结论:再生颗粒可以提升兔股骨头坏死骨保护素mRNA的表达水平,抑制骨保护素配体的表达,从而促进坏死骨组织的修复。     

甲状旁腺激素对成人成骨细胞护骨素和护骨素配体及其相关因子的调节

目的：探讨甲状旁腺激素（PTH）调节骨吸收作用的途径和机制。方法：观察PTH对人成骨细胞(HOB)表达护骨素(OPG)、护骨素配体(OPGL)及其相关因子,如肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(TRAIL)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的影响,用RT-PCR法检测OPG,OPGL,TRAIL及M-CSF基因表达情况,用Western blotting分析法检测OPG和OPGL蛋白表达情况。结果：PTH下调HOB细胞中OPG的表达,上调OPGL,M-CSF及TRAIL的表达。结论：PTH通过降低成骨细胞中OPG与OPGL的比值,增加M-CSF和TRAIL的表达,促进破骨细胞生成、活化,促进骨吸收。     

不同微种植体支抗材料对护骨素与护骨素配体基因表达的影响

目的评价不同种植体支抗材料镍铬合金、钴铬合金、钛和聚乳酸酯对人成骨样细胞MG-63的细胞毒性及护骨素(Osteoprotegerin,OPG)与OPG配体即破骨细胞分化因子(Receptor activator nuclear factor-kappa Bligand,RANKL)mRNA的表达量的影响。方法选择人成骨样细胞系MG-63作为细胞毒性的实验对象,分为5组,即对照组,浓度为0.05%的镍铬、钴铬、聚乳酸酯、钛微粒各一组。用MTT法检测细胞存活率;用半定量RT-PCR检测在相同浓度的各种材料的作用下,人成骨样细胞内OPG/RANKL mRNA的表达变化。结果浓度为0.05%的不同粒子对人成骨样细胞MG-63的细胞毒性及OPG/RANKL mRNA的表达量的影响:(1)镍铬微粒对细胞生长有一定的抑制作用,钛微粒则有较强的抑制作用;钴铬微粒和聚乳酸酯微粒对细胞的增殖无明显的副作用。(2)镍铬微粒对细胞OPG的表达产生抑制作用,与对照组比较,差别有统计学意义;钴铬微粒和聚乳酸酯微粒对细胞OPG的表达无明显影响,与对照组比较差别无统计学意义;钛粒子诱导OPG在细胞中的表达量大大增加,与对照组比较差别具有统计学意义。(3)镍铬微粒可有效诱导人成骨样细胞中RANKL的表达,钴铬微粒对RANKL的表达具有一定的诱导效果,两者与对照组比较,镍铬微粒诱导效果更强,呈现显著性差异,钴铬微粒则呈现一般性显著;而钛微粒则显著增加RANKL的表达量;聚乳酸酯对人成骨样细胞中RANKL的表达则无明显的诱导作用,与对照组比较,差别无统计学意义。结论聚乳酸酯材料的细胞毒性最小,对OPG/RANKL mR-NA的表达量影响最小;钛次之;而镍铬、钴铬合金对OPG/RANKL mRNA的表达量有一定的影响。     

龈沟液中核因子活化因子受体配体和骨保护素水平的检测

目的检测龈沟液(gingivalcervicalfluid,GCF)中核因子活化因子受体配体(receptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)水平,探讨GCF中RANKL、OPG及RANKL/OPG与慢性牙周炎的关系。方法采用滤纸条法收集牙周健康者(health,H)和慢性牙周炎患者(chronicperiodontitis,CP)GCF样本,用ELISA法检测GCF中RANKL和OPG浓度,同时对检测牙的根尖片进行灰度分析。结果CP组GCF中RANKL浓度(118.93±41.91)pg/μL明显高于H组(39.15±14.83)pg/μL(P<0.01);CP组GCF中OPG浓度(70.73±23.47)pg/μL明显低于H组(261.28±99.13)pg/μL(P<0.01);CP组GCF中RANKL/OPG的比值(1.95±1.07)高于H组(0.19±0.13)(P<0.01)。CP组GCF中RANKL和OPG浓度及RANKL/OPG比值与菌斑指数(plaqueindex,PLI)和龈沟出血指数(sulcusbleedingin-dex,SBI)无明显相关;OPG浓度与牙周探诊深度(probingdepth,PD)和牙周附着丧失(attachmentloss,AL)呈负相关关系;RANKL浓度和RANKL/OPG比值与患牙根尖片灰度呈负相关关系。结论GCF中RAN-KL和OPG水平及RANKL/OPG的比值与牙周组织的炎症状态相关性不明显,但与慢性牙周炎患者牙周组织的骨破坏有明显相关,提示GCF中RANKL、OPG及RANKL/OPG的比值可作为慢性牙周炎牙槽骨组织破坏的一项较敏感和客观的指标。     

应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒(HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的pSIHBV／C与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞,转染后24、48、72h,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体pSIHBV／C,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌,转染后第2天抑制率达高峰,分别为92％、85％,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染24b后,随pSIHBV／C比例的升高,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加,当pSIRNA／C与pHBV1．3比例为1：20时,pSIHBV／C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。     

RNA干扰技术抗乙型肝炎病毒的实验研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果。RNA干扰技术的出现，为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。作者主要从RNA干扰技术的研究背景、实验中存在的问题和应用前景等方面对其抗HBV的研究进展进行综述。     

短干涉RNA特异性抑制白血病细胞中肺耐药相关蛋白基因表达

背景和目的双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,导致转录后水平的基因沉默。肺耐药相关蛋白的过度表达与白血病细胞多药耐药密切相关。本研究旨在探讨自行设计的LRP特异性siRNA能否发挥特异性降解LRPmR-NA、抑制蛋白质表达的作用。方法构建LRP真核表达载体pcDNA3．0／LRP。以pcDNA3．0／LRP、pEGFP-C1、二者的特异性siRNA分别组和,转染K562细胞。以RT-PCR方法和流式细胞术检测LRP mRNA和蛋白质水平的变化,以荧光显微镜检测GFP的表达的变化。结果K562细胞转染pcDNA3．0／LRP后,LRP mRNA水平明显升高,蛋白质表达由阴性转为阳性,阳性率30％;LRP特异性siRNA与pcDNA3．0／LRP共同转染K562细胞,LRP mRNA和蛋白质表达均明显降低,由阳性转为阴性;LRP特异性siRNA与pEGFP-C1共同转染K562细胞,GFP的表达与pEGFP-C1单独转染无差异;GFP特异性siRNA与pcDNA3.0共同转染K562细胞,LRP mRNA水平和蛋白质表达与pcDNA3．0／LRP单独转染无差异。结论LRP特异性siRNA在K562细胞中能够特异性地降解LRP mRNA、抑制其蛋白质表达。该研究将为利用siRNA逆转LRP引起的白血病细胞MDR奠定理论基础。     

小干扰RNA体外抑制HBs-GFP融合基因的表达

目的:利用增强型绿荧光蛋白(EGFP)和小发夹RNA(shRNA)表达载体技术,建立一种行之有效且相对经济的验证siRNA的方法.方法:将HBV S基因融合到EGFP中,建立HBs-GFP融合基因表达载体;同时构建带U6 27 RNA转录启动子的shRNA表达载体pAVU6 4sh357.二载体共转染HepG2细胞后,流式细胞仪检测HBs-GFP蛋白的荧光强度;同时RT-PCR和实时定量PCR法检测HBs-GFP mRNA水平的改变.结果:小干扰RNA有效抑制目的基因的表达,共转染后第72 h荧光蛋白抑制率为55.4%;HBs-GFP 融合基因的RNA表达受到显著抑制,抑制率达到90%.结论:载体法表达的小干扰RNA体外显著抑制HBs-GFP融合基因的表达.     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

RNA干扰技术特异性抑制骨肉瘤survivin的表达

目的:体外转录合成survivin siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U2-OS中抑制survivin的表达情况.方法:体外转录合成survivin序列特异性双链RNA(dsRNA),转染U2-OS细胞株中,用RT-PCR和Western blot法检测转染前后survivin基因的mRNA和蛋白的表达,MTF法检测细胞增殖,观察U2-OS细胞生物学特性的改变.结果:转染特异性siRNA的细胞其survivin mRNA及蛋白表达均下调,干涉后细胞的增殖受到抑制.结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制骨肉瘤细胞株U2-OS中survivin的表达,抑制细胞的增殖,RNA干扰技术为骨肉瘤的治疗提供了一种新策略.     

应用siRNA表达框架进行原代细胞RNA干扰的操作方法

介绍应用siRNA表达框架对原代培养的细胞进行RNA干扰。RNA干扰是由双链RNA介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程,它已经广泛应用到基因功能研究、基因表达调控机制和抗病毒感染等热门领域,在哺乳动物的原代细胞中进行RNA干扰的研究为功能基因研究提供了重要意义。siRNA表达框架与脂质体的转染率直接影响RNA干扰的效果,本文介绍了如何设计和构建siRNA表达框架,筛选最佳的靶位点。