Survivin siRNA对人肺腺癌细胞SPCA1和SH77抑制作用的比较分析

背景与目的 Survivin是IAP家族的新成员,具有抑制凋亡和调节细胞增殖的双重作用,是迄今发现最强的凋亡抑制因子。本项研究的目的是通过将survivin的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体分别转染至肺癌细胞SPCA1和SH77,分析survivin siRNA对不同肺癌细胞的增殖抑制作用。方法构建靶向survivin的siRNA表达载体与pSi scrambled,经由脂质体法分别转染至肺癌细胞SPCA1和SH77。通过MTT法检测细胞增殖抑制,用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期,利用半定量RT-PCR和Western blot印迹法分别检测细胞survivin mRNA及蛋白表达水平。结果 Survivin siRNA干预后,SPCA1和SH77细胞均出现凋亡,G0/G1期阻滞。实验组Survivin mRNA水平和蛋白表达水平比脂质体对照组明显减少。结论 Survivin基因特异性RNA干扰可以明显抑制肺癌SPCA1和SH77细胞的体外增殖并诱导明显的细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

β-catenin基因沉默抑制人骨肉瘤U2OS细胞增殖的体外实验研究

目的:研究siRNA 干扰β-catenin对人骨肉瘤U2OS细胞增殖能力的影响。方法:利用脂质体Lipofectamine 2000将靶向β-catenin的siRNA转染人骨肉瘤U2OS细胞,Western blot技术检测β-catenin基因沉默效果。分别采用CCK-8法和流式细胞学技术检测细胞增殖和周期,Western blot检测cyclin D1的蛋白表达。结果:siRNA干扰有效阻断了人骨肉瘤U2OS细胞的β-catenin表达。β-catenin siRNA转染U2OS细胞48h、72h后,与空白组和阴性对照组相比,细胞增殖能力显著下降,细胞周期明显阻滞于G0/G1期,细胞中cyclin D1蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论:特异性抑制β-catenin基因表达可抑制人骨肉瘤U2OS细胞增殖。     

沉默S100A4基因对人膀胱癌T-24细胞生物学特性的影响

目的:探讨应用siRNA 技术沉默S100A4基因表达后,对人膀胱癌细胞系T-24增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响。方法:设计并合成S100A4 基因特异性的siRNA 序列,转染人膀胱癌细胞系T-24,48h后应用RT-PCR 和Western blot法检测在mRNA 和蛋白水平siRNA 对S100A4的影响,MTT 法检测T-24细胞增殖能力,流式细胞术检测转染S100A4 siRNA 后T-24细胞凋亡率,Transwell 法观察siRNA 抑制S100A4 后对人膀胱癌细胞系侵袭能力的影响。结果:与空白对照组、阴性对照组相比,S100A4 siRNA转染组T-24细胞的S100A4基因和蛋白表达降低(P＜0.05)。MTT法检测发现S100A4 siRNA转染组细胞增殖率明显下降（P＜0.01）;流式细胞术检测siRNA转染组细胞凋亡率高于其他各组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Transwell小室实验检测发现T-24细胞侵袭能力明显下降（P＜0.05）。结论:膀胱癌细胞中S100A4 表达与癌细胞侵袭、增殖和凋亡能力有关。S100A4 siRNA 能够抑制T-24细胞S100A4的表达,进而抑制细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。S100A4基因和蛋白表达与膀胱癌的生物学特性密切相关,可能成为预测其发生转移和复发,以期指导临床治疗的重要指标。     

靶向survivin的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的抑制作用

目的：探讨针对人survivin基因的siRNA对骨肉瘤细胞MG63的体内外抑制作用。方法：合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过Annexin V法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下MG63移植瘤的形成。结果：成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞MG63/pSiS。与MG63、MG63/pSi（空质粒对照细胞）相比,MG63/pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0.01）;Western blotting显示,MG63/pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0.01）。MG63/pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论：Survivin特异性siRNA可明显促进骨肉瘤细胞MG63的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

RNA干扰沉默mdm2治疗骨肉瘤的实验研究

目的 观察靶向mdm2的小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤生长的影响.方法 构建PGCsilencerTM-mdm2 siRNA,转染至骨肉瘤细胞U2OS.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测siRNA对mdm2的沉默效果,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用流式细胞术检测诱导细胞凋亡的情况.通过裸鼠移植瘤模型观察siRNA对骨肉瘤体内治疗效果.结果 成功构建simdm2质粒.在转染simdm2的U20S细胞中,simdm2-1组和simdm2-2组的mdm2 mRNA表达量分别下降至空白对照组的35.6%和42.1%(P<0.05),mdm2蛋白表达分别降低至空白对照组的34.0%和47.2%(P<0.05),而且增殖能力显著降低,发生明显凋亡,simdm2-1组和simdm2-2组的细胞凋亡率分别为29.9%和20.9%.阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义.裸鼠移植瘤实验结果显示,simdm2转染组的肿瘤受到抑制,而且mdm2基因和蛋白表达明显下调.结论 simdm2能有效的抑制骨肉瘤生长,并抑制mdm2基因和蛋白的表达.     

siRNA干扰STAT3基因对食管癌Eca-109细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3信号传导通路对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:针对人STAT3基因mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,将其连入pRNAT-U6.1/neo质粒中,构建STAT3-siRNA表达载体,稳定转染人食管癌Eca-109细胞,利用RT-PCR、Western blot技术分别检测转染细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,MTT实验、流式细胞技术检测转染细胞的增殖、细胞周期和凋亡变化情况.结果:成功构建STAT3-siRNA表达载体,经测序鉴定正确.RT-PCR和Western blot结果显示,STAT3-siRNA3表达载体明显抑制了人食管癌Eca-109细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT实验显示,稳定转染siRNA后,siRNA3实验组细胞的增殖能力明显下降,细胞生长抑制卒为35.68%,较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞技术显示,siRNA3实验组出现了细胞周期阻滞和细胞凋亡,细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞凋亡率为13.26%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);结论:RNA干扰技术沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表达,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖,引起细胞周期G_0/G_1期阻滞,促进其凋亡.     

小干扰RNA沉默survivin基因对结肠癌Caco-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察survivin在人结肠癌细胞Caco-2中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默survivin基因对survivin蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响.方法:以脂质体LipofectAMINE 2000为载体,将针对特异靶点survivin基因的siRNA转染入人结肠癌细胞Caco-2.应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测survivin蛋白表达的变化,MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞凋亡.结果:免疫细胞化学检测结果显示,survivin蛋白在Caco-2细胞空白对照组、脂质体对照组及阴性错配对照组的细胞质中均呈强阳性表达,而在survivin-siRNA转染组细胞质中呈弱阳性表达;Western印迹法检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组、脂质体对照组和阴性错配对照组;MTT检测结果显示,与阴性错配对照组相比, survivin-siRNA转染组细胞生长出现明显的抑制(P＜0.05),且不同时段(24、48和72 h)的肿瘤细胞增殖抑制率之间差异有统计学意义(P＜0.05);FCM检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞出现明显的亚二倍体峰,细胞凋亡率(9.72%)明显高于空白对照组(P＜0.01).结论:siRNA沉默survivin基因可抑制结肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡.推测survivin基因可能成为结肠癌基因治疗的一个新靶点.     

反义寡核苷酸抑制survivin基因表达及肝癌细胞生长的研究

目的:采用反义寡核苷酸抑制肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其对肝癌细胞生长的作用.方法:采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,Western blot及原位杂交方法检测survivin蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测凋亡细胞比率,检测转染前后细胞贴壁率变化,并绘制细胞生长曲线.结果:survivin反义寡核苷酸转染后,肝癌细胞survivin蛋白及mRNA表达均显著降低,细胞贴壁率显著降低,细胞增殖活性明显受抑,细胞凋亡率显著增加.结论:survivin反义寡核苷酸转染可以有效降低细胞内survivin基因的表达,诱导细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

长链非编码RNA TUG1调控miR-138-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)牛磺酸调节基因1(TUG1)调控miR-138-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:在骨肉瘤细胞U-2OS中转染TUG1 siRNA和siRNA control,qRT-PCR测定干扰效果,MTT测定增殖,流式细胞术测定凋亡,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移。starBase预测TUG1与miR-138-5p有结合位点,双荧光素酶报告载体鉴定靶向调控关系。将miR-138-5p抑制物和TUG1 siRNA共转染至骨肉瘤细胞中,测定干扰miR-138-5p对下调TUG1的骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。结果:转染TUG1 siRNA后的骨肉瘤细胞中TUG1表达水平明显低于转染siRNA control后的细胞（P<0.05）。下调TUG1后的骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力降低,细胞凋亡率升高（P<0.05）。野生型TUG1荧光素酶报告载体与miR-138-5p共转染后细胞荧光素酶活性降低（P<0.05）。与转染TUG1 siRNA的细胞比较,miR-138-5p抑制物和TUG1 siRNA共转染后的细胞增殖、侵袭和迁移能力升高,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论:下调LncRNA TUG1表达通过调控miR-138-5p表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力并诱导细胞凋亡。     

lncRNA RHPN1-AS1靶向miR-485-5p调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及其分子机制

目的:探讨lncRNA RHPN1反义RNA1（RHPN1-AS1）靶向miR-485-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和机制。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测20例骨肉瘤组织与其对应的癌旁组织、人正常成骨细胞hFOB1.19以及3种骨肉瘤细胞（U-2OS、SAOS-2、HOS）中RHPN1-AS1和miR-485-5p的表达水平。利用脂质体转染法将RHPN1-AS1小干扰RNA（si-RHPN1-AS1）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、miR-485-5p模拟物（miR-485-5p mimics）、miRNA阴性对照（miR-NC）分别转染U-2OS细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印记（Western blot）检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、p27、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和基质金属蛋白酶14（MMP-14）蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证RHPN1-AS1和miR-485-5p的靶向调控关系。结果:与癌旁组织比较,骨肉瘤组织中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）;与hFOB1.19细胞比较,3种骨肉瘤细胞中RHPN1-AS1的表达水平显著升高,miR-485-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）。与si-NC组比较,si-RHPN1-AS1组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表达水平显著降低,p21、p27和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）;与miR-NC组比较,miR-485-5p组U-2OS细胞的活力显著降低,迁移和侵袭能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著降低,p21和Bax蛋白的表达水平显著升高（P＜0.05）。RHPN1-AS1靶向负性调控miR-485-5p表达。干扰miR-485-5p表达逆转了抑制lncRNA RHPN1-AS1表达对骨肉瘤U-2OS细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结论:抑制RHPN1-AS1通过上调miR-485-5p抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡。     

miR-139-5p靶向GPR56抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的实验研究

目的:研究miR-139-5p对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制。方法:运用qRT-PCR检测软骨肉瘤细胞中miR-139-5p、GPR56的mRNA表达;Western blot检测细胞中GPR56的蛋白表达;将miR-139-5p组（转染miR-139-5p mimics）、miR-NC组（转染miR-NC）、si-NC组（转染si-NC）、si-GPR56组（转染si-GPR56）、miR-139-5p+pcDNA3.1组（miR-139-5p mimics和pcDNA3.1共转染）、miR-139-5p+pcDNA3.1-GPR56组（miR-139-5p mimics和pcDNA3.1-GPR56共转染）,均以脂质体法转染至U-2OS细胞;MTT法检测各组细胞的增殖;Transwell检测各组细胞的迁移、侵袭。结果:与人正常成骨细胞hFOB1.19相比,人骨肉瘤细胞U-2OS中miR-139-5p表达显著降低,GPR56表达显著升高（P＜0.05）。过表达miR-139-5p、敲减GPR56均可明显抑制U-2OS细胞增殖、迁移、侵袭;GPR56是miR-139-5p的靶点。过表达GPR56可逆转miR-139-5p对U-2OS细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论:miR-139-5p可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭,其机制可能与靶向GPR56有关,将可为骨肉瘤的治疗提供新靶点。     

Notch1 siRNA影响Notch-Wnt信号通路对人成骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

背景与目的：骨肉瘤是骨肿瘤中最常见的原发性恶性肿瘤。迄今为止,骨肉瘤发生、发展的相关分子机制尚不明确,临床上也没有针对性的有效治疗药物。该研究探索Notch1蛋白在骨肉瘤中的作用及与影响骨肉瘤发生、发展的Notch-Wnt信号通路之间的关系。方法：采用免疫组织化学染色法检测骨肉瘤组织中Notch1的表达;采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法与流式细胞术检测靶向Notch1siRNA转染的人骨肉瘤细胞MG-63与U-2 OS凋亡的影响,实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）、蛋白质印迹法（Western bolt）检测转染后骨肉瘤细胞内Notch与Wnt信号通路中相关蛋白及RIPK4蛋白的表达变化。结果：Notch1在人骨肉瘤活检组织中的表达呈阳性,同时Notch1 siRNA能够显著抑制人骨肉瘤MG-63和U-2 OS细胞的增殖,并促进骨肉瘤细胞发生凋亡。此外诱导降低或缺失Notch1后,Notch与Wnt信号通路中相关蛋白及RIPK4蛋白表达明显减少。结论：siRNA-Notch1脂质体转染骨肉瘤细胞后,可影响Notch1-Wnt信号通路并降低促增殖分子RIPK4的表达,发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。     

癌基因MSP58在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖的影响

目的:研究MSP58基因在骨肉瘤组织中的表达,探讨干涉MSP58基因对体外培养的U2OS骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:利用Real-time PCR（n=15）和Western blot（n=7）方法分别检测新鲜骨肉瘤及癌旁组织中MSP58 mRNA和蛋白的表达情况,并以癌旁组织作为对照。用癌基因MSP58特异的siRNA转染U2OS骨肉瘤细胞,而后采用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。结果:与癌旁组织相比,MSP58基因mRNA和蛋白水平在骨肉瘤组织中的表达明显升高（P<0.05）。干涉MSP58基因表达明显抑制U2OS骨肉瘤细胞增殖,同时G1期细胞明显增多,G2/M期和S期细胞明显减少（P<0.05）。结论:MSP58基因在骨肉瘤肿瘤组织中过度表达,下调MSP58表达可抑制骨肉瘤细胞增殖。     

沉默TRIM29对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向三联基序蛋白29（TRIM29）对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（QPCR）法检测骨肉瘤细胞株（MG63和U2OS）的TRIM29水平,采用脂质体法将两条靶向TRIM29的siRNA片段（siTRIM29-1和siTRIM29-2）高效转染至MG63和U2OS细胞,经QPCR法检测后选取抑制效率最高的siRNA进行后续实验,并设转染siControl的MG63和U2OS细胞为对照;分别采用MTT、流式细胞术及Transwell 法检测转染后MG63和U2OS细胞的增殖、凋亡及侵袭情况。结果 QPCR检测结果显示MG63和U2OS细胞的TRIM29 mRNA水平较正常成骨细胞株hFOB1-19均升高（P＜0.05）;MG63和U2OS细胞转染siTRIM29-1和siTRIM29-2片段72 h后的TRIM29 mRNA水平均低于转染siControl的细胞,差异均有统计学意义（P＜0.05）,同时选取沉默率较高的siTRIM29-1进行后续实验;与转染siControl的MG63和U2OS细胞相比,两种细胞转染siTRIM29-1后的存活率及穿膜细胞数目减少,凋亡率升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 骨肉瘤细胞中TRIM29高表达,且靶向沉默TRIM29可抑制骨肉瘤细胞增殖及侵袭并诱导细胞凋亡,对骨肉瘤靶向治疗有一定参考价值。     

EPHA2-siRNA质粒对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨骨肉瘤细胞中EPHA2基因表达对细胞增殖、凋亡以及仿血管发生的影响。方法应用pSiliencer质粒构建靶向EPHA2的siRNA质粒;脂质体转染siRNA质粒人骨肉瘤细胞,Western blot在蛋白水平检测转染前后细胞基因表达情况;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪结合Annexin V-FITC和PI染色以及HE染色观察转染前后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及仿血管发生情况。结果成功构建了针对EPHA2的siRNA表达质粒;将质粒转染入骨肉瘤后,EPHA2基因在蛋白表达水平下调;骨肉瘤细胞增殖能力下降,并发生了早期凋亡,骨肉瘤细胞的仿血管发生受到抑制。结论EPHA2参与了骨肉瘤细胞增殖、早期凋亡和仿血管发生;利用RNA干扰技术靶向EPHA2基因治疗可能为骨肉瘤治疗提供新方法。