三种抗人细胞色素P450酶合成肽抗体的制备及应用研究

目的 制备兔抗人细胞色素P450酶142、3A4及4A11的特异性抗体,对其在药物代谢方面的应用进行研究.方法 ①利用生物信息学方法 分析CYP1A2、CYP3A4及CYP4A11蛋白的序列,利用DNAstar软件中蛋白质的亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构指标选择多肽序列,应用Blast软件对所选序列进行同源性分析并合成多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联,免疫大耳白兔制备抗CYP1A2、3A4及4A11抗体.抗体纯化后经酶联免疫吸附(ELISA)、免疫印迹(Western blot)鉴定其特异性;②通过制备大鼠给药模型利用Western blot评价上述抗体在药物代谢酶分析方面的作用.结果 获得抗CYP1A2、CYP3A4及CYP4A11合成肽的抗体.Western blot结果 显示,三种抗体均可与其合成肽及天然CYP1A2、CYP3A4及CYP4A11蛋白出现特异性反应,识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)分别为63 000、59 000及53 000.同时,Western blot结果 显示,所制备的抗体能识别药物诱导后大鼠天然CYP1A2、CYP3A4及CYP4A11.结论 合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体.制备的抗体特异性良好,可应用于药物代谢酶方面的研究.     

弓形虫CDPK5基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定

目的：筛选弓形虫（Tg）CDPK5基因序列的免疫多肽,将合成多肽免疫新西兰白兔制备多抗血清,并对其功能进行鉴定。方法利用生物信息学的方法分析确定Tg CDPK5序列免疫多肽,再用合成的多肽免疫新西兰白兔制备多抗。收集多抗血清,酶联免疫吸附测定（ELISA）测定多抗滴度,蛋白免疫印迹法（Western blot）鉴定免疫活性,免疫荧光实验分析Tg CDPK5的亚细胞定位。结果通过生物信息学分析,选择Tg CDPK5序列N端一段长17 bp的多肽序列作为免疫多肽;用合成的多肽免疫兔子,成功获得多抗血清。ELISA测定多抗血清效价为1∶640000;Western blot证明该多抗血清能特异性识别 Tg CDPK5（75．4×103）条带;免疫荧光实验结果表明,该多抗能特异性识别弓形虫内源Tg CDPK5蛋白。结论研究根据 Tg CDPK5序列信息的分析,获得Tg CDPK5序列免疫多肽,并制备兔源多克隆抗体。     

抗小鼠PGRP-L单表位多克隆抗体的制备

目的 制备抗小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)单表位多克隆抗体.方法 应用生物信息学技术预测小鼠mPGRP-L分子的B细胞优势表位,人工合成抗原肽,采用MBS法将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫家兔获取mPGRP-L抗血清,采用HiTrap proteinG柱和抗原肽亲和层析柱纯化抗体,以ELISA和Western blotting进行鉴定.结果 确定了位于mPGRP-L分子N端第85～104位残基的1个B细胞优势表位NH2-(C)DPHSLSPELQALISEVAQHDCOOH,合成短肽并制备KLH-肽偶联物,免疫家兔得到的抗血清效价达1:256 000.分别以HiTrap protein G柱和抗原肽柱亲和层析纯化获得兔抗mPGRP-L单表位多克隆抗体mPGRP-Lnl和mPGRP-Ln2.纯化抗体能与重组蛋白pET-mPGRP-Ln结合,经Western blotting分析,在相对分子质量约29 000处可见清晰的反应条带.结论 获得抗mPGRP-L单表位多克隆抗体,为mPGRP-L分子的研究提供了工具.     

基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用

 目的 制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能。 方法 将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽（MDFSVKVDIEKEVTC）与钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）偶联，免疫新西兰白兔制备抗血清；将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱, 兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体；采用ELISA测定抗体效价、Western blot来鉴定抗体特异性，并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位。 结果 获得了抗TRIM22特异性抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白。利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中。 结论 该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具。     

泡球蚴Em18多克隆抗血清的制备和鉴定

目的：制备和鉴定泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清.方法： 利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18-GST蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源抗Em18多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法鉴定其特异性.结果： （1）SDS-PAGE检测表明,rEm18-GST蛋白得到成功表达,在相对分子量为50 kDa处有表达条带.（2）纯化后获得高纯度的rEm18-GST蛋白.（3）ELISA结果表明,抗Em18抗血清的抗体滴度为1∶25 600;Western blot结果表明抗Em18抗血清能与rEm18-GST蛋白发生特异性结合.结论： 获得了特异性识别rEm18-GST蛋白的多克隆抗体,为进一步筛选Em18模拟抗原表位奠定基础.     

细粒棘球蚴热休克蛋白70重组抗原的免疫学特性研究

目的鉴定纯化的重组细粒棘球蚴热休克蛋白70(EgHSP70)的免疫学特性。方法对已构建的阳性表达菌EgHSP70/pGEX-6P-1进行大量诱导表达后纯化,用EgHSP70和HSP70/GST作抗原制剂分别免疫小鼠,制备抗血清,通过ELISA法和Western blot法对重组EgHSP70的免疫学特性进行鉴定。结果ELISA法检测结果表明,原头蚴、囊液等天然抗原均可被免疫小鼠血清识别,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot显示免疫小鼠血清能够有效识别重组蛋白,同时重组EgHSP70也可被免疫兔血清识别。结论纯化后的重组蛋白EgHSP70具有较好的免疫原性和抗原性,可望作为包虫病疫苗候选分子,值得进一步深入研究。     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

腺相关病毒衣壳保守区多价抗原肽的原核表达及多克隆抗体制备

目的 原核表达和纯化腺相关病毒（AAV）衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法 设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组（1只/组）,实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果 成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论 诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。     

人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-1高特异性抗体的制备

目的 制备人补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白1（hCTRP1）的特异性抗体.方法 合成了hCTRP1的C端抗原肽并免疫新西兰大白兔,利用亲合纯化色谱柱对抗体进行了纯化.结果 间接ELISA测定表明,抗血清效价达1∶64 000,Western印迹及ELISA验证表明纯化抗体具有很高的特异性.结论 人工合成的hCTRP1抗原肽免疫新西兰大白兔,制备了高效价的抗血清,并纯化制备了hCTRP1特性抗体.     

小鼠组蛋白去乙酰化酶2多肽抗血清的制备

目的利用人工合成小鼠组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)多肽制备特异性抗HDAC2抗血清,用于相关疾病的体内外诊断。方法根据HDAC2基因编码的氨基酸序列合成多肽,与载体偶联后免疫动物,所制备的抗血清用ELISA、Western blot及免疫组织化学方法鉴定。结果 ELISA检测表明所制备的抗血清可同多肽抗原发生阳性反应,效价1∶4 000;Western blot结果显示抗血清可与多肽抗原及APP/PS1转基因小鼠的脑组织发生反应;免疫血清1∶100,1∶200,1∶400,1∶800四个稀释度均能与小鼠脑组织中的HDAC2反应。结论所制备的多肽抗血清可识别组织及血清中的HDAC2,可应用于相关领域的体内外研究。