基因DNA双链直接测序及其在肿瘤诊断中的应用

本世纪70年代以后发展起来的DNA测序技术,在分子遗传研究中起了巨大作用,大量基因的DNA序列被测定,使一些遗传病和肿瘤与基因的关系研究深入     

单链多聚酶链反应直接测序检测血小板GPⅡb和GPⅢa基因点突变杂合子

单链多聚酶链反应直接测序检测血小板ＧＰⅡｂ和ＧＰⅢａ基因点突变杂合子陈方平９０年代以来的分子生物学研究表明：血小板无力症的分子缺陷大部分为血小板ＧＰⅡｂ和ＧＰⅢａ基因突变［１］。检测点突变杂合子或疾病携带者在人类优生和亲缘鉴定上具有重要意义。为了探讨...     

焦磷酸测序法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 建立基于焦磷酸测序技术的胰腺癌K-ras基因点突变的检测方法,并与Sanger测序法作一比较.方法 用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)和Sanger测序法(Sanger sequencing)分别在10名正常胰腺组织、49例胰腺癌、11例慢性胰腺炎、18例胰腺良性囊肿、7例胰岛素癌、9例壶腹癌、7例胆管癌及7例十二指肠乳头癌石蜡包埋组织的DNA中检测K-rag基因12密码子点突变.结果 采用上述两种方法在所有正常胰腺组织、慢性胰腺炎、胰腺良性囊肿、胰岛素癌、壶腹癌、胆管癌及十二指肠乳头癌均未见K-ras基因点突变,而采用焦磷酸测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-ras基因点突变率为71.4%(35/49),显著高于采用Sanger测序法发现胰腺癌石蜡包埋组织K-rag基因点突变率(61.2%,30/49).结论 焦磷酸测序法较Sanger测序法更为敏感,且焦磷酸测序法准确、快速、高通量,适合临床标本的批量测定.     

高通量测序技术在循环肿瘤DNA检测中的应用

目的 肿瘤是影响人类生命的重要威胁因素,肿瘤的早期诊断、预后及疗效评估有利于提高患者的生存率.目前临床上癌症的伴随诊断主要依靠肿瘤组织病理、内窥镜等检查,但都存在侵入性和异质性的问题.而在肿瘤细胞DNA中发生的分子变化如突变、易位和甲基化等,在循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)中也...     

von Willebrand因子基因外显子28Arg611 His突变导致的2型血…

为阐明ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）基因外显子２８发生突变导致的血管性血友病（ｖＷＤ）的基因缺陷，应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术获得ｖＷＦ基因外显子２８，分１０个基因片段（Ｃ￣Ｌ）用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）技术筛选ｖＷＤ患者的基因突变，对变性行为有改变的片段直接测序。在一例２型ｖＷＤ患者ｖＷＦ基因外显子２８的５＇端，ＤＧＧＥ显示波动明显减慢的条带，直接测序表明发生Ｇ→Ａ杂合突变，导     

应用DNA测序技术检测血友病B患者FⅨ基因突变

为了研究3名中国汉族非亲缘系血友病B患者凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变的类型,常规检测患者血浆APTT及FⅨ：C,进行表型诊断;抽提患者外周血白细胞基因组DNA,应用PCR技术分8段扩增FⅨ基因外显子序列,用双脱氧终止法检测核酸序列,结果表明：与正常对照者相比,HB患者APTT测定值明显升高,FⅨ：C测定值明显降低,胛测定值正常、测序结果显示3例HB患者均有相应的基因序列改变,患者1有外显子6G22119A点突变,患者2有外显子1G7932C点突变,患者3有外显子T32685C点突变。结论：3例HB患者均检测到相应的基因序列改变,这为HB患者基因缺陷的分子机制提供了证据.     

质粒DNA抗原酶联免疫吸附试验检测抗双链DNA抗体的研究

目的 建立以质粒DNA为抗原的检测血清抗双链DNA(ds-DNA)抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法及探讨其临床应用价值。方法 将原核表达载体质粒pBV220用碱裂解法提取纯化DNA后，按1：150稀释包被在多聚-L-赖氨酸处理的微孔板上，以辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)为酶标记物，建立检测血清抗双链DNA抗体的ELISA方法。并以短膜虫为底物的间接免疫荧光法(IIF)为参比方法，对6_4例系统性红斑狼疮(SLE)、8例混合性结缔组织病、17例类风湿性关节炎患者的血清抗ds-DNA抗体进行对比检测。结果 紫外分光法于波长260nm测DNA浓度为1．54g/L。ELISA抗ds-DNA法和IIF法检测3组患者阳性率分别为23．4％和17．2％、12．5％和12．5％、11．8％和5．9％，符合率分别为93．8％、100％、94．1％。以经典IIF法为金标准，ELISA检测抗ds-DNA抗体的特异性为93．4％，敏感性为100％。结论 用质粒DNA作抗原建立的检测血清抗ds-DNA抗体具有良好的精密度、敏感性和特异性，检出率高于IIF法，有助于对SLE的诊断和病情活动程度进行监测。     

肿瘤循环线粒体DNA研究现状

近年来日益增多的研究表明,肿瘤在生长过程中会持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液.释放的DNA根据核基因和核外基因分为循环核DNA (nuclear acid,nDNA)和循环线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA).目前,几乎所有研究都集中于循环nDNA,循环mtDNA鲜有关注.为此,我们从定性和定量两个方面,对国际上已报道的关于循环mtDNA方面的研究进行归类综述,初步探讨循环mtDNA在肿瘤发生发展中的生物学意义进行,阐明循环mtDNA在肿瘤诊断以及疗效监测中潜在的临床应用价值.     

中国人凝血因子Ⅸ基因MseⅠ多态性

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和限制性内切酶ＭｓｅⅠ酶解分析，发现我国人群凝血因子ＩＸ（ＦｌＸ）基因５’侧翼－６９８位核苷酸存在ＭｓｅＩ多态性，该多态性由８３ｂｐ／５８ｂｐ＋２５ｂｐ组成。在受检的１１８个ＦＩＸ基因中，二者基因频率分别为０．６３５和０．３６５，多态性信息量为０．４６３。此系我国人群中发现的第二种限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ），有助于血友病乙携带者的检测及产前基因诊断。     

人及小鼠干细胞因子的cDNA克隆及其序列分析

作者合成了一段与人和小鼠干细胞因子（ＳＣＦ）ｃＤＮＡ能特异性互补的寡核苷酸探针，经放射性同位素标记，与两株人骨髓基质细胞系（ＨＥＣＬ、ＨＦＣＬ）和一株小鼠骨髓基质细胞系（ＴＣ－１）的ＲＮＡ进行点杂交。结果表明这三株基质细胞都能表达ＳＣＦｍＲＮＡ。因此，作者利用逆转录－多聚酶链反应技术扩增编码ＳＣＦ的部分ｃＤＮＡ序列，并将其克隆入ｐＵＣ１８载体。ＤＮＡ序列分析结果显示作者所克隆的ＳＣＦｃＤＮＡ序列与文献报道的一致。     

原发性肝癌患者病毒标志物检测及介入治疗对HBVDNA的影响

目的研究乙型肝炎病毒DNA和血清标志物与原发性肝癌的关系以及介入治疗前后HBVDNA和肝功能的变化。方法对151例肝癌患者做HBV-m，HBVDNA和AH，测定，对14例肝癌病人介入前后测HBVDNA和肝功能。结果肝癌患行HBV总感染牢为9668％．以HBsAg、抗HBe、抗HBc3e项同时阳性模式（俗称小三阳）最多见，占53．64％（81／151）。其次为HBsAg、HBeAg、抗H8c3项同时阳性（俗称大三阳）占20．52％（31／151）。小三阳中HBVDNA阳性占74．07％（60／81）；AFP阳性率63，6％（91／143），介入治疗引起肝功能损害加重，HBVDNA水平升高，前背有最著悱芹异，后者无显著性差异。结论HBV感染与肝癌发生密切相关，而且以H8sAg、抗HBe、抗HBe3项同时阳性馍式最多见，该模式巾大部分患者HBVDNA处于复制活跃状态；介入治疗引起肝功能损害加重，对HBVDNA水平的影响戊引起重视。     

HBV前S2蛋白检测与HBV—DNA和乙肝二对半模式相关性研究

[目的]探讨HBV前S2蛋白检测与HBV—DNA和乙肝二对半标志物模式的相关性及其临床价值。[方法]应用PCR法和ELISA法对216例HBV—DNA和HBV血清标志物、前S2蛋白同时进行平行检测。[结果]“大三阳”患者前S2蛋白和HBV—DNA阳性率分别为42．9％和86．7％，“小三阳”患者前S2蛋白和HBV—DNA阳性率分别为3．4％和13．6％，血清前S2蛋白和HBV—DNA检出率比较两者存在密切相关性（X^2=38．01，P〈0．005）；以HBV—DNA检测为标准，HBeAg的灵敏度为87．7％，前S2蛋白灵敏度为43．4％，HBeAg和前S2蛋白与HBV—DNA的总符合率分别为87．5％和68．9％。[结论]HBV前S2蛋白检测对HBV感染的诊断价值较低，但可作为HBeAg和HBV—DNA的补充指标。     

原发性肝癌患者病毒标志物检测及介入治疗对HBV DNA的影响

目的研究乙型肝炎病毒DNA和血清标志物与原发性肝癌的关系以及介入治疗前后HBV DNA和肝功能的变化。方法对151例肝癌患者做HBV-m,HBV DNA和AFP测定,对14例肝癌病人介入前后测HBV DNA和肝功能。结果肝癌患者HBV总感染率为96.68%,以HBsAg、抗HBe、抗HBc3c项同时阳性模式(俗称小三阳)最多见,占53.64%(81/151),其次为HBsAg、HBeAg、抗HBc 3项同时阳性(俗称大三阳)占20.52%(31/151)。小三阳中HBV DNA阳性占74.07%(60/81);AFP阳性率63.6%(91/143),介入治疗引起肝功能损害加重,HBV DNA水平升高,前者有显著性差异,后者无显著性差异。结论HBV感染与肝癌发生密切相关,而且以HBsAg、抗HBe、抗HBc 3项同时阳性模式最多见,该模式中大部分患者HBV DNA处于复制活跃状态;介入治疗引起肝功能损害加重,对HBV DNA水平的影响应引起重视。     

海洋刺参多糖对宫颈癌细胞周期的影响及其机制

目的研究海洋刺参多糖（SJAMP）对人宫颈癌细胞系HeLa细胞周期影响并探讨其作用机制。方法实验分为对照组（不用SJAMP）及1.6、3.26、.4 g/L不同剂量SJAMP组。应用免疫细胞化学法分别检测各组SJAMP对增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期抑制蛋白Mdm2表达的影响;流式细胞仪检测不同浓度SJAMP对HeLa细胞周期的影响。结果与对照组相比较,1.6、3.2和6.4 g/L SJAMP组均能抑制PCNA和Mdm2的表达（F=209.02~951.11,q=18.97~74.55,P〈0.05）,且具有一定的浓度依赖和时间依赖关系。经SJAMP处理的HeLa细胞发生G1期阻滞,对照组及1.6、3.2、6.4 g/L SJAMP组细胞的凋亡率分别为0.25%、4.32%、11.36%和30.04%,差异有显著性（F=26.95~259.21,q=3.34~36.36,P〈0.05）。结论 SJAMP对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用。其机制可能是SJAMP降低PCNA和Mdm2蛋白的异常表达,使细胞周期发生G1期阻滞,从而起到抑制细胞增殖的作用。     

几种消毒法对乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎人血清聚白蛋白受体灭活作用的研究

比较了8种消毒剂以及热力与紫外线对HBsAg与HBV-pH SA~r的破坏作用。HBV-pH SA~r的受性一般低于HBsAg。建议在HBV灭活试验中将HBV-pHSA~r亦作为一标志物进行测定。     

甲型肝炎病毒PCR检测结果与其感染性关系的研究

据检测，以３００μＷ／ｃｍ２紫外线照射１０分钟，或用１％过氧化氢处理３０分钟，对甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）感染性的灭活率为９９．９９％，但用ＰＣＲ法未检出５＇端非编码区的扩增片段；经紫外线照时２０分钟，ＨＡＶ感染性虽全部消失，但仍可检出Ｐ１区扩增片段。结果表明，ＨＡＶ感染性的有无与ＰＣＲ扩增产物检出与否无平行关系．     

肝硬化病人左右半肝形态及其相关因子表达变化

目的探讨乙型肝炎肝硬化病人左右半肝形态及肝组织标本肝硬化相关因子基质金属蛋白酶-2（MMP2）、碱性成纤维细胞生长因子-2（bFGF2）的表达。方法对30例乙型肝炎肝硬化致门脉高压征行脾切除术和乙型肝炎肝硬化失代偿行肝移植手术病人行CT检查,手术中标本摄片,留取形态学资料。同时留取病人肝组织标本,进行苏木精-伊红染色,根据0～4期标准判断肝纤维化程度,并行免疫组化染色检测MMP2和bFGF2的表达。结果肝硬化病人右半肝萎缩较左半肝萎缩明显;苏木精-伊红染色显示右半肝肝硬化较左半肝明显。病例组左、右半肝MMP2的表达明显高于对照组左、右半肝的表达（χ^2=19.45、17.60,P〈0.01）;病例组右半肝MMP2的表达明显高于左半肝（χ^2=17.37,P〈0.01）。病例组左半肝bFGF2的表达与对照组比较无统计学差异,而右半肝bFGF2的表达明显高于对照组（χ^2=5.80,P〈0.05）;病例组右半肝bFGF2的表达明显高于左半肝（χ^2=11.09,P〈0.01）。结论肝硬化时左右半肝纤维化程度存在明显差异,MMP2和bFGF2的表达可能对病变程度起作用。     

微波消毒口腔石膏模型的实验研究

目的评价微波消毒法对口腔石膏模型的消毒效果。方法用细菌定量检测和基因扩增荧光定量技术,对微波照射消毒口腔石膏模型的效果进行了观察。结果用输出功率120 W微波炉对染菌口腔石膏模型进行照射消毒。照射5 min,可完全杀灭污染在口腔石膏模型上的枯草芽孢杆菌,并可完全灭活污染在口腔石膏模型上的乙型肝炎病毒DNA。结论普通家用微波炉在满功率条件下照射5 min,可有效杀灭污染在口腔石膏模型上的细菌和病毒。