用逆转录－多聚酶链反应检测白血病患者多药耐药基因的表达

作者应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测２５例急性白血病患者骨髓细胞中ｍｄｒ＿１基因的表达。以Ｋ５６２敏感细胞和体外诱导的耐药细胞株Ｋ５６２／Ａ０２分别作为阴性和阳性对照，发现复发和未缓解患者中ｍｄｒ＿１表达增高者占９０．９％（１０／１１），而初治患者中仅为２１．４％（３／１４），ｍｄｒ＿１表达增高者化疗效果差。应用单克隆抗体ＪＳＢ－１检测Ｐ－１７０结果与ＲＴ－ＰＣＲ一致。此ＲＴ－ＰＣＲ具有高度敏感性，可以检出２Ｐｇ的ｍｄｒ＿１ｃＤＮＡ，对于检测白血病ｍｄｒ＿１的表达是一种灵敏、特异的方法。     

人类白血病耐药细胞系K562／VCR mdr1及GST表达的研究

建立了一种高度敏感、特异性强并能定量的逆转录／多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测ｍｄｒ１ ｍＲＮＡ的方法，用该法研究Ｋ５６２／Ｓ及Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系ｍｄｒ１基因表达。结果显示Ｋ５６２／ＶＣＲ有较高水平ｍｄｒ１基因表达（０．８６），而Ｋ５６２／Ｓ未检测到表达。此外，利用酶学方法和点杂交方法在蛋白质和ｍＲＮＡ水平上检测了Ｋ５６２／Ｓ和Ｋ５６２／ＶＣＲ中谷脱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性及其基因表达，发现     

急性髓细胞白血病患者多药耐药基因mdr1表达的研究

为了评估患预后，用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究了２７例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）患骨髓细胞中ｍｄｒ１ｍＲＮＡ表达，同时用３例正常人白细胞、敏感Ｋ５６２和耐药Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系作对照。     

反义基因逆转肿瘤细胞多药耐药诱导细胞凋亡的研究

目的：探讨克服肿瘤细胞多药耐药（ＭＤＲ）的方法，提高化疗效果。方法：采用多药耐药反义基因（ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ）逆转Ｋ５６２／ＡＤＭ肿瘤细胞的ＭＤＲ，而诱导肿瘤细胞凋亡。结果：ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ诱导Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞产生大量ＤＮＡ断片，流式细胞仪检测发现几乎全部ｍｄｒ－１＋Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞发生凋亡。结论：ｍｄｒ－１－ＡＳＰＳ－ＯＤＮ能有效、特异地抑制ｍｄｒ－１基因表达，逆转肿瘤细胞的ＭＤＲ，促进阿霉素诱导Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞凋亡，为其临床应用提供理论依据。     

白细胞介素2和α干扰素逆转白血病细胞多药耐药的研究

目的：探讨细胞因子对人白血病细胞系Ｋ５６２／Ｓ及其多药耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２的影响。方法：以ＭＴＴ法测定小剂量细胞因子作用后柔红霉素（ＤＮＲ）的毒性变化；用荧光法测定细胞内药物浓度；用免疫组化法检测ｐ－膜糖蛋白（ｐ－ｇｐ）变化；用ＲＴ－ＰＣＲ法检测多药耐药基因（ｍｄｒ－１）ｍＲＮＡ。结果：发现ＤＮＲ对Ｋ５６２／Ａ０２及Ｋ５６２／Ｓ的半数抑制率（ＩＣ５０）分别为４５．０８μｇ／ｍｌ及０．６０７μｇ／ｍｌ。α干扰素（ＩＦＮ－α）和白细胞介素２（ＩＬ－２）作用２４小时可增加ＤＮＲ对Ｋ５６２／Ａ０２的细胞毒作用，与未加药组相比ＩＣ５０下降为１６．３９及１１．９６μｇ／ｍｌ，但不影响Ｋ５６２／Ｓ细胞（ＩＣ５０无明显改变）。且ＩＦＮ－α、ＩＬ－２可提高细胞内ＤＮＲ浓度，从未加药组的２１５１ｎｇ／ｍｇ蛋白到２５７０及２５０３ｎｇ／ｍｇ蛋白。但ｐ－ｇｐ及ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ无明显改变。结论：ＩＦＮ－α、ＩＬ－２可增加ＤＮＲ对Ｋ５６２／Ａ０２细胞的毒性作用，增加Ｋ５６２／Ａ０２细胞内的药物浓度，但不是通过下调ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ机制而起逆转作用。     

人类白血病耐药细胞系K562／VCRmdrl及GST表达的研究

建立了一种高度敏感、特异性强并能定量的逆转录／多聚酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测ｍｄｒｌｍＲＮＡ的方法，用该法研究Ｋ５６２／Ｓ及Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系ｍｄｒｌ基因表达。结果显示Ｋ５６２／ＶＣＲ有较高水平ｍｄｒｌ基因表达（０．８６），而Ｋ５６２／Ｓ未检测到表达。此外，利用酶学方法和点杂交方法在蛋白质和ｍＲＮＡ水平上检测了Ｋ５６２／Ｓ和Ｋ５６２／ＶＣＲ中谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活性及其基因表达，发现Ｋ５６２／ＶＣＲ中ＧＳＴ活性明显高于Ｋ５６２／Ｓ（Ｐ＜０．００５），且该种活性的增高是由ＧＳＴπ、ＧＳＴμ过度表达引起。     

急性髓细胞白血病患者多药耐药基因mdrl表达的研究

为了评估患者预后，用ＲＴ－ＰＣＲ方法研究了２７例急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）思者骨髓细胞中ｍｄｒｌｍＲＮＡ表达，同时用３例正常人白细胞、敏感Ｋ５６２和耐药Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞系作对照。结果发现所有复发与难治性ＡＭＬ患考ｍｄｒｌｍＲＮＡ均有较高水平表达（０．６９３±０．１０８），而初治组中１８例仅有５例ｍｄｒｌｍＲＮＡ表达（０．３０５±０．１１８），明显低于复发难治组（Ｐ＜０．００１）。正常人及Ｋ５６２细胞系无表达，而Ｋ５６２／ＶＣＲ有较高水平表达（０．８６）。结合患者病情分析，得出结论是ｍｄｒｌｍＲＮＡ表达可作为ＡＭＬ患者不良预后的预测指标之一。     

耐药人白血病细胞GSH含量、GST活力及其同工酶、MRP表达的研究

目的：了解多药耐药基因（ｍｄｒ１）机制以外导致人白血病细胞耐药的因素。方法：采用生化方法，对Ｋ５６２和ＨＬ６０敏感和耐药细胞株谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴ）活力进行测定；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）ｍＲＮＡ表达进行检测；用Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交对ＧＳＴα、π、μ蛋白表达进行检测。结果：与敏感株相比，Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ的ＧＳＨ含量、ＧＳＴ活力明显增高，ＨＬ６０／Ａｄｒ的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力无明显增高，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交可见ＧＳＴα、π和ＧＳＴπ、μ在Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ过度表达，ＨＬ６０／Ａｄｒ无ＧＳＴ同工酶过度表达，ＭＲＰ在三种耐药株均有过度表达。结论：ＧＳＨ、ＧＳＴ和ＭＲＰ参与了Ｋ５６２／Ｈ２０和Ｋ５６２／ＶＣＲ耐药，ＨＬ６０／Ａｄｒ耐药与ＧＳＨ、ＧＳＴ无关，与ＭＲＰ有关。在实际应用中，应对多种耐药指标同时进行检测     

用RT－PCR测血清中柯萨奇B组病毒基因初探

本文用ＲＴ－ＰＣＲ对１００例临床不同病人血清中柯萨奇Ｂ组病毒基因作了检测，其阳性结果分别为：心血管疾病患者１９．６％（１０／５１），内科原因不明发热忍者７．１％（２／２８），儿科患者４．７％（１／２１），总阳性率为１３％（１３／１００）。并将阳性结果与心电图检查进行比较分析，以探讨ＰＣＲ技术对心肌炎疾病的诊断应用。     

恶性淋巴瘤患者多药耐药的研究

应用逆转录－多聚酶链反应技术及免疫组化方法对２５例初治及２５例复发的恶性淋巴瘤患者的多药耐药进行了前瞻性分析。结果发现：初治患者仅８％（２／２５），而复发患者６０％（１５／２５）ｍｄｒｌｍＲＮＡ表达阳性（Ｐ＜０．０１）；初治患者仅４％（１／２５），而复发患者４８％（１２／２５）ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）表达阳性（Ｐ＜０．０１）；ｍｄｒ１ｍＲＮＡ及Ｐ－ｇｐ表达阳性患者的化疗有效率（ＣＲ－ＰＲ）明显低于ｍｄｒ１ｍＲＮＡ及Ｐ－ｇｐ表达阴性的患者（Ｐ＜０．０１）。结果表明：ｍｄｒｌ基因及Ｐ－ｇｐ表达的检测对恶性淋巴瘤患者化疗的敏感性及预后具有预测价值，可为临床化疗方案的个体化提供依据。     

干扰素逆转白血病细胞多药耐药性的研究及机制的初步探讨

以人白血病细胞系Ｋ５６２／Ｓ及多药耐药细胞系Ｋ５６２／Ａ０２为对象，通过ＭＴＴ法测柔红霉素（ＤＮＲ）细胞毒性（ＩＣ５０），用流式细胞仪及荧光法测细胞内ＤＮＲ浓度，逆转录－多聚酶链反应法检测多药耐药基因ｍＲＮＡ，发现小剂量ＩＦＮ－α（５００Ｕ／ｍｌ）可增加ＤＮＲ对Ｋ５６２／Ａ０２细胞的毒性作用。加用ＩＦＮ－α与未加用组相比，ＩＣ５０下降至原来的１／１３．７，而ＩＬ－２（２５０Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（０．１５μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ（２５０Ｕ／ｍｌ）作用组与对照组ＩＣ５０无明显改变。并发现ＩＦＮ－α可提高耐药系Ｋ５６２／Ａ０２细胞内ＤＮＲ浓度，在１５０分钟时升高了６．３倍。ｍｄｒ１ｍＲＮＡ在ＩＦＮ－α作用组与对照组无明显改变，认为ＩＦＮ－α不是通过下调ｍｄｒ１ｍＲＮＡ而达逆转作用     

白血病患者WT1基因的表达及其临床意义

目的：探讨ＷＴ１基因在白血病细胞中的表达及其临床意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法测定Ｋ５６２、ＨＬ－６０、ＴＦ－１及Ｕ９３７四株白血病细胞系，４５例白血病患者，１５名正常人外周血及１０例非血液病患者正常骨髓细胞ＷＴ１基因的表达。结果：Ｋ５６２、ＨＬ－６０及ＴＦ－１三株白血病细胞系均高度表达ＷＴ１，而Ｕ９３７细胞系未测到ＷＴ１。急性髓系白血病（ＡＭＬ）２５例中２１例、急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）１１例中８例、慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）急性变者２例、慢性及加速期ＣＭＬ患者７例中１例ＷＴ１表达阳性。１５名正常人外周血及１０例非血液病患者正常骨髓细胞ＷＴ１基因表达阴性。结论：ＷＴ１基因在大多数急性白血病中表达，与白血病的病程发展可能有关，可作为检测白血病微量残留病的特异性标记。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

RARα／MYL融合mRNA是诊断和监测急性早幼粒细胞白血病的特异标志

应用四条引物（Ｒ＿５，Ｒ＿６，Ｄ＿３，Ｄ＿４）通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了２０例初治急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患者的ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ。建立的方法可在０．１ｎｇ细胞总ＲＮＡ中检出ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ，相当于在１０￣４～１０￣５个正常细胞中检出一个ＡＰＬ细胞，扩增产物的特异性经ＫｐｎＩ酶切法确认。１８例患者表达Ｂ型融合ｍＲＮＡ（２９０ｂｎ片段），２例表达Ａ型（３１１ｂｐ片段）。２例患者在完全缓解（ＣＲ）达４周和１６周时仍可检出融合ｍＲＮＡ。１例患者在ＣＲ期ＲＴ－ＰＣＲ检测持续阳性，４周后；临床复发。４例在ＣＲ期随访９～２９周融合ｍＲＮＡ均阴性。２例急性白血病在维甲酸治疗前拟诊ＡＰＬ，但ＲＴ。ＰＣＲ检测阴性，这２例对维甲酸治疗无效，核型分别是ｔ（８；２１）和正常。我们认为，ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ与ＭＹＬ／ＲＡＲα融合ｍＲＮＡ一样，也是诊断和监测ＡＰＬ的一个敏感和特异的标志。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562/A02细胞株多种耐药机制的调节

目的研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒ１、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法应用细胞培养技术,采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性,增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显著下调ｍｄｒ１、ＧＳＴπ的ｍＲＮＡ和蛋白表达,明显上调ＴｏｐｏⅡα基因表达。Ｋ５６２敏感株的ＧＳＴπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。ＭＲＰ基因表达的变化差异无统计学意义。结论ＮＯＭ和ＤＲＯ可明显逆转Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对ＡＤＭ的耐药性。ＮＯＭ与异搏定逆转强度相似;两药对ｍｄｒ１、ＧＳＴπ和ＴｏｐｏⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。     

柯萨奇B组病毒RNA PCR的改进

应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测患者血清中柯萨奇Ｂ组病毒ＲＮＡ，在反应中采用了逆转录活性的聚合酶（ＲＴ－Ｔａｑ酶），使逆转录和ＰＣＲ一次加样完成，并对心脏病患者进行了检测，现将结果报告如下。１材料与方法１．１病人来源均为本院住院病人，经临床...     

逆转录酶／聚合酶链反应检测早幼粒细胞白血病PML－RARα融合基因对预后和微量残留白血病细胞检测的意义

应用逆转录酶／聚合酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）技术检测９７例中国人急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ），其中包括３５例初发期患者，４４例缓解期患者，以及１８例进行动态观察的患者，发现二种ＰＭＬ－ＲＡＲα融合ｍＲＮＡ异构体（Ｌ型或Ｓ型）存在于５２例初发期ＡＰＬ中，其早期死亡率和复发率Ｓ型高于Ｌ型，两者预后差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０２５）。６２例缓解期患者中有１１例ＰＣＲ阳性，其中５例于检测后１～６个月内复发，６例经强化治疗后仍处缓解期，其中１例化疗２疗程后ＰＣＲ转阴，提示ＲＴ／ＰＣＲ确实为检测微量残留白血病细胞的一项极灵敏方法，可作为预报ＡＰＬ复发的一项指标。     

白血病和多发性骨髓瘤患者多药耐药基因的表达

近３年来我们应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术检测了白血病等５８例（１０８份标本）血液系统恶性疾病患者治疗过程中的多药耐药基因（ｍｄｒ１）表达，并结合临床进行了分析。病例和方法１研究对象血液系统非恶性疾病３０例，男１２例，女１８例，年龄２１...     

用通用引物建立的RT-PCR诊断肠道病毒性脑炎及脑膜炎

目的　用通用引物建立逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），达到广谱、特异及快速诊断肠道病毒（ＥＶ）性脑炎及脑膜炎。方法　用针对ＥＶ基因组５’端非编码区保守区的１对通用引物建立的ＲＴ－ＰＣＲ检测多种ＥＶ标准血清型，同时检测病毒性脑膜炎和脑炎患儿的脑脊液。结果　此种ＲＴ－ＰＣＲ可检测４２种ＥＶ的标准血清型，所用毒株在１０－１ＴＣＩＤ５０时仍可见到１９４ｂｐ的阳性条带。检测了３２例病毒性脑膜炎和脑炎患儿的脑脊液中ＥＶ－ＲＮＡ，１８例为阳性（５６．３％）。ＥＶ－ＲＮＡ阳性患儿的昏迷、瘫痪、抽搐、ＣＳＦ－蛋白质及低密度灶数（ＣＴ）分别为４（２２．２％）、８（４４．４％）、１２（６６．７％）、４６２ｍｇ／Ｌ（ｘ）及４（２２．２％）；ＥＶ－ＲＮＡ阴性患儿的昏迷、瘫痪、抽搐、ＣＳＦ－蛋白质、及低密度灶数（ＣＴ）分别为１０（７１．４％）、６（４２．９％）、１２（８５．７％）、３８６ｍｇ／Ｌ（ｘ）及４（２８．８％），仅昏迷发生率有极显著差异（Ｐ＜０．０１）。结论　用通用引物建立的ＲＴ－ＰＣＲ诊断ＥＶ性脑膜炎和脑炎，具有广谱性、特异性、敏感性及简洁、快速的特点，诊断ＥＶ性脑膜炎和脑炎主要依靠病原学检查。     

用PCR技术检测白血病患者MDR1基因表达

用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测了５２例急性白血病（ＡＬ）患者与８例正常人临床标本多药耐药基因（ＭＤＲ１）的表达,并观察患者对化疗药物的反应。结果表明：初诊未化疗者ＭＤＲ１阳性表达率为１５．６３％,提示ＭＤＲ的原发性;复发和未缓解者ＭＤＲ１表达率产７１．４３％,显著高于初治者。ＭＤＲ１阳性表达组完全缓解率为１３．３３％,显著低于ＭＤＲ１阴性表达组（〉７７．４２％）。认为该项检测对指导