登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２ ４３） 感染的Ｃ６／３６ 细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ 为模板,进行Ｄ２ ４３ 株ＮＳ３ 基因ｃＤＮＡ 片段的反转录 ＰＣＲ 扩增,片段长度为１１７６ ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ 片段克隆到Ｔ 载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｋｓⅡ（ ＋ ） 中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

一种直接高效克隆PCR产物的载体制备

Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ经ＥｃｏＲ Ｖ酶切后，在Ｔａｑ酶作用下加入ｄＴＴＰ使其３’端加上碱基“Ｔ”而成为３’端突出的粘性末端载体。用此载体直接与ＰＣＲ产物连接进行克隆。克隆效率比采用平端载体克隆的效率提高约５０倍。     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

可溶性E—选择素cDNA基因克隆及其真核表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素重组质粒经ＰＣＲ扩增得到可溶性Ｅ－选择素ｃＤＮＡ基因，将此基础插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｓｍａ Ｉ位点，构建了正向表达质粒ｐＪＳＡ１１７５．可溶性Ｅ－选择素，采用脂质供共转染的方法，将上述质粒转染ＴＫ＾－１４３细胞。     

人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达

目的：人血小板生成素（ＴＰＯ）在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用ＰＣＲ技术,扩增出了（１－１７４个氨基酸的）人血小板生成素ｃＤＮＡ,并将其克隆到ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定。表达产物ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的（１－１７４氨基酸）ＴＰＯｃＤＮＡ片段;表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ相对分子质量     

在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出完整的丙型肝炎病毒核心蛋白基因，将其克隆于表达载体ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子的下游，构建了重组质粒ｐＢＶ－ＨＣＶ；转化大肠杆菌后，以非融合蛋白方式表达了丙型肝炎病毒核心蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示，此蛋白的分子量约为２０ｋＤａ，表达量约占菌体蛋白的１１％；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹实验证明，此蛋白能与慢性丙型肝炎患者血清发生特异反应。序列分析结果表明，克隆于ｐＢＶ     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能     

PCR技术在鉴定阳性重组子中的应用

介绍了采用ＰＣＲ技术在人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）、人促红细胞生成素及中国人γ－干扰素（ｈＩＦＮ－γ）ｃＤＮＡ重组质粒的构建过程中快速鉴定阳性重组子的方法。经ＰＣＲ扩增鉴定为阳性的重组子，提取质粒ＤＮＡ经重组位点相应的ＤＮＡ内切酶双酶切鉴定表明，全部含有插入片段。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究通过反转录ＰＣＲ得到人ＧＭ-ＣＳＦ基因片段后，通过重组插入ｐＢＶ２２０载体质粒的ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ之间，构建了重组表达质粒ｐｈＧＭ９１。借助计算机分析，优化了构建质粒的转译起始区，采取定点诱变以消除ＳＤ序列和ＡＴＧ区的强二级结构，提高了表达水平。将ＧＭ-ＣＳＦ基因进行序列测定，与文献报导完全一致，所对应的氨基酸序列与天然氨基酸序列一致。将带有表达质粒ｐｈＧＭ９１的ＤＨ５α菌在４２℃诱导，表达了预期的１５ＫＤ的蛋白，约占菌体总蛋白的２０％，并探讨了不同菌株对表达水平的影响。用ＭＴＴ法测定所表达的ＧＭ-ＣＳＦ生物活性，比活性可达到１×１０~７ＩＵ／ｍｇ，表明所表达的ＧＭ-ＣＳＦ具有生物学作用。     

小鼠内皮抑素基因克隆、表达及其抑瘤活性鉴定

利用ＲＴ－ＰＣＲ法从小鼠肝细胞扩增出Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,重组人ｐＵＣ１９质粒。经测序后,将片段重且人大肠杆菌表达载体ｐＤＨ并用温度诱导表达。将表达的蛋白经纯化及复性后直接注入大鼠Ｃ６胶质瘤模型内,检测其对胶质瘤生长的抑制作用。结果,在小鼠肝组织中成功扩增到Ｅｎｄｏｗｓｔａｔｉｎ基因,测序与报道列一致重组进一致。重组进ＰＤＨ后经温度诱导表达,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳上得到一条新的蛋白表达带,分子     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白 产生

获得得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析，方法用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，     

PCNA基因反义RNA表达质粒的构建及人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应

为观察ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应,用ＤＮＡ重组法将人ＰＣＮＡ基因反向克隆到真核细胞表达质粒ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中,构建成ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲ－ＰＣＮＡ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮ＾ＴＭ介导转梁人胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１,并接种于裸鼠背部皮下。经Ｇ４１８筛选获得的转染细胞系ＳＧＣ／ＰＣＮＡ与亲本细胞相比,其生长速度减慢,ＲＮＡ、蛋白质生物合成受到抑制,Ｓ期、     

反义bcr／ab1重组逆转录病毒表达载体的构建及其转染对K562细胞系的影响

用逆转录聚合酶链反应技术从Ｋ５６２细胞系中扩增出ｂｃｒ／ａｂ１融合区２５３ｂｐＤＮＡ片段，经反复连接与克隆，得到含同方向串联的２、３和４个拷贝的该融合基因片段的克隆载体ｐＵＣｓ。这些片段分别反向连接到逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲｎｅｏ。ＤＮＡ序列分析、限制性内切酶分析和菌落原位杂交证实：不同拷贝数的ｂｃｒ／ａｂ１融合区基因片段已反向插入ｐＤＯＲｎｅｏ。利用脂质体介导，将重组质粒导入Ｋ５６２细胞系后，观察到转染细胞的增殖明显被抑制     

限制性内切酶诱发DNA双链断裂在细胞中的修复忠实性

用限制性内切酶ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＶ分别处理双标记基因质粒（ｐＳＶｎｅｏ－ｇｐｔ）ＤＮＡ，在ｇｐｔ基因序列上产生双链断裂，然后将其导入ＣＨＯ细胞中，研究受损基因在细胞中的修复忠实性。结果显示由ＥｃｏＲＶ产生的平齐末端ＤＮＡ双链断裂在细胞中的修复忠实性高于由ＫｐｎＩ酶产生的粘性末端ＤＮＡ双链断裂。还用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交检测了部分转化克隆中酶切ｇｐｔ序列的重接．     

神经元烟碱受体β2亚基基因克隆和原核细胞表达

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法从孵育至１２天的鸡胚视叶顶盖中提取ＲＮＡ。ｃｈｏｅｐｆｅｒ报道的序列设计引物，引物的５端添加ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切位点。通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到１．４８ｋｂ长的ＣＤＮＡ片段，用ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切ＣＤＮＡ后插入质粒ＰＵＣ１９。测序采用Ｓａｎｇｅｒ双氧终止法，结果与文献报道一致。将β基因克隆入ＰＢＶ２２０原核表达载体中，宿主菌经４２℃诱导，经ＳＤ     

PCNA基因反义RNA表达质粒的构建及对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应

为观察ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ表达质粒对人胃癌裸鼠移植瘤的抑制效应,用ＤＮＡ重组法将人ＰＣ－ＮＡ基因反向克隆到真核细胞表达质粒ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中,构建成ＰＣＮＡ基因真核表达质粒ｐＤＲ－ＰＣＮＡ,用ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＴＭ介导转染人胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１,并接种于裸鼠背部皮下。经Ｇ４１８筛选获得的转染细胞系ＳＧＣ／ＰＣＮＡ与亲本细胞相比,其生长速度减慢,ＲＮＡ、蛋白质生物合成受到抑制,Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期ＤＮＡ含量降低,移植瘤生长速度减慢,瘤体平均直径（０．５４±０．１３）ｃｍ,明显小于对照组（１．５１±０．１１）ｃｍ。结果表明,ＰＣＮＡ基因反义ＲＮＡ表达质粒对胃癌裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用。     

分泌抗HIVp24单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步鉴定

以含人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）核心抗朱ｐ２４全部氨基酸序列的重组蛋白ｐＧ１免疫小鼠，用免疫脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，成功地建立了５株分泌抗ＨＩＶｐ２４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。经鉴定，这５株ＭｃＡｂ与乙肝核心抗原（ＨＢｃＡｇ），丙肝Ｃ区，ＮＳ－３区抗原不发生交叉反应，而与重组ｐ２４抗原产生特异反应，本组单抗的研制成功为建立检测ＨＩＶｐ２４抗原的方法奠定了基础。     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

人表皮生长因子基因的克隆及其真核表达载体的构建

人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）具有促进表皮细胞增殖的作用，与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展，人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔１〕。为了进行ｈＥＧＦ基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究，我们采用逆转录ＰＣＲ方法扩增了ｈＥＧＦ及其信号肽基因，并选用ｐＢＫＣＭＶ穿梭质粒构建了ｈＥＧＦ基因真核表达质粒。１　材料和方法１．１　主要试剂限制性内切酶ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４Ｄ…     

rhTPO克隆及其在COS—7细胞中的瞬时表达

血小板生长因子（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）是一种正常生理状态下的造血生长因子，它刺激造血祖细胞向巨核细胞的分化及血小板的生成和释放。该实验从６月龄人胚肝脏中分离ＲＮＡ，经逆转录ＰＣＲ等步骤克隆出了ＴＰＯｃＤＮＡ，并进行了序列分析。将ＴＰＯｃＤＮＡ亚克隆至哺乳动物细胞瞬时表达载体ｐＣＭＶ４，形成了重组表达质粒ｐＣＭＶ４／ＴＰＯ。以该重组质粒转染ＣＯＳ７细胞，可测到ＴＰＯ在ＣＯＳ７细胞中的瞬时表达