肝癌相关蛋白HCAP1的表达、抗体制备及其亚细胞定位

目的：肝癌相关基因HCAP1蛋白产物的表达、抗体的制备及其亚细胞定位。方法：原核表达HCAP1蛋白；纯化的HCAP1蛋白免疫新西兰大白兔，制备多抗血清；Western blot分析其在肝癌细胞株的表达；通过荧光免疫细胞化学进行亚细胞定位。结果：获得了较纯的HCAP1表达蛋白和高效价的、高特异性的抗HCAP1的多抗血清，并且发现HCAP1大部分位于胞浆，少量分布于核仁。结论：表达的HCAP1蛋白和抗HCAP1的多抗血清可用于HCAP1基因功能的研究；HCAP1功能场所可能位于核仁。     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

TAX1BP1调控B细胞自噬和凋亡的研究

目的 探究TAX1BP1在B细胞自噬与凋亡中的作用。方法 慢病毒感染B淋巴瘤细胞（Raji细胞）,敲低TAX1BP1表达。利用雷帕霉素处理Raji细胞,通过Western blot、细胞免疫荧光染色和流式细胞术,观察自噬流强弱以及细胞凋亡情况。通过检测自噬相关通路P53蛋白表达变化,初步探索调控机制。结果 荧光显微镜观察慢病毒感染阳性率在90%以上。与阴性组比较,shTAX1BP1组细胞中TAX1BP1的m RNA表达水平降低80%、蛋白表达水平降低90%。经10 nmol/L雷帕霉素处理后,与阴性组相比较,shTAX1BP1组LC3II/I比值显著下降（P<0.01）,凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著升高,Bax、Caspase-3表达显著下降。敲低TAX1BP1降低Raji细胞自噬水平,减少Raji细胞凋亡。敲低TAX1BP1增加P53蛋白表达,推测TAX1BP1可能通过P53相关通路调控Raji细胞的自噬与凋亡。结论 敲低TAX1BP1可抑制Raji细胞自噬与凋亡,初步预测这一生物学作用可能与P53信号通路有关。本研究为进一步探讨SLE的发病机制奠定了一定的实验基础。     

B7-1 mAb对B系淋巴瘤Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用

为了研究B7 1分子功能性mAb (6H2 )对表达B7 1分子的B系淋巴瘤Raji细胞的生物效应。分别运用免疫荧光标记和流式细胞仪技术 (FACS )、台盼蓝拒染试验、MTT试验和RT PCR半定量分析 ,分析 6H2对Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。结果显示 ,6H2能抑制天然表达B7 1分子的人B系淋巴瘤Raji细胞的生长 ,产生细胞周期G2 /M的阻滞 ,上调细胞表面CD18和CD95 (Fas )的表达 ,且能使Raji细胞中Bax的相对转录表达显著增加 ,从而诱导Raji细胞的凋亡。 6H2为功能性抗人B7 1分子特异性mAb ,具有抑制Raji细胞生长和凋亡诱导作用 ,在B系淋巴瘤研究和生物治疗中具有应用价值。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

人C1q分子对Raji,U937细胞产生IL—1活性的抑制调节

为探讨Ｃ１ｑ与免疫细胞产生的ＩＬ－１活性的关系，采用Ｒａｊｉ，Ｕ９３７及对照ＭｏｌＴ４三株培养细胞与Ｃ１ｑ共同孵育２０ｈ后收集细胞上清、以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－１活性，结果显示Ｃ１ｑ能明显抑制Ｒａｊｉ及Ｕ９３７细胞ＩＬ－１活性，对ＭｏｌＴ４细胞无此作用，Ｆ（ａｇ‘）２ａｎｉｔＣ１ｑ可阻断此抑制作用。     

NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达

目的： 克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法：从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果：NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4 mRNA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论：NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。     

抗人CD86嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji生长抑制及杀伤作用研究

目的:研究CD86嵌合抗体ch1D1对天然高表达CD86分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji增殖抑制及杀伤效应.方法:经流式细胞术检测ch1D1对Raji细胞表面CD86分子的识别;经ch1D1(终浓度10 μg/ml)处理Raji细胞,MTT法检测对Raji细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测ch1D1诱导Raji细胞表面FasL及Fas的表达;MTT法检测ch1D1介导的外周血单个核细胞(PBMCs)对Raji为靶细胞的ADCC效应.结果:ch1D1可特异性识别Raji细胞表面CD86分子,阳性结合率为97.5%.ch1D1对Raji细胞增殖的抑制率为27.1%,较鼠源性亲本抗体1D1组(抑制率为38.8%)略下降,但两者统计学比较无差异(P＞0.05).与CD80嵌合抗体ch4E5联合应用抑制率可达56.3%,明显高于ch1D1单独作用的抑制率(P＜0.05).ch1D1作用4小时后,Raji细胞表达FasL水平开始升高,处理72小时阳性表达率为6.8%,较亲本抗体1D1组(阳性表达率3.2%)升高,但统计学比较无显著差异(P＞0.05);经ch1D1作用24小时,Raji细胞Fas表达水平开始上调,阳性率为6.1%,较1D1组(阳性表达率4.8%)升高,但无统计学差异(P＞0.05).与ch4E5联合应用均较ch1D1单独作用Fas及FasL的表达水平升高,但统计学比较仍无显著差异(P＞0.05).经ch1D1处理4、24、48、72小时,介导PBMC对Raji细胞杀伤率分别为25.0%、52.0%、71.3%、72.7%,与人IgG1及鼠源亲本抗体对照组相比均明显升高,具有显著差异(P＜0.05).结论:抗人CD86嵌合抗体可抑制高表达CD86分子的肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,与嵌合抗体Fc段介导的ADCC效应具有协同抗肿瘤作用.     

CD5阳性B1细胞增殖易感基因的定位

目的 :定位NZB、NZW及NZB WF1小鼠外周血B1细胞增殖的易感基因。方法 :建立 (NZB×NZW )F1×NZB回交小鼠模型 ,用覆盖小鼠全部常染色体的多态性微卫星遗传标记数量性状位点 (QTL)分析进行基因定位。结果 :B1细胞增殖的易感基因与小鼠的第 2、4、17号染色体上的微卫星遗传标记D2Mit 10 1、D4Mit 11及D17Mit 6 1肯定连锁 (Lods值 >3) ,其中D2Mit10 1、D4Mit11位点来源于NZB ,D17Mit 6 1位点来源于NZW。在D2Mit10 1位点附近存在Ltk、Rag1、2基因 ,在D4Mit 11位点附近存在Lck基因 ,在D17Mit6 1位点附近存在H 2及TNF α基因。结论 :NZB、NZW及NZB WF1小鼠外周血B1细胞增殖受多基因调控 ,易感基因分别位于NZB的Ltk、Rag1、2及Lck基因编码区和位于NZW的H 2、TNF α基因编码区 ,这些易感基因之间有相互促进的叠加效应。     

Raji B cells, misidentified as THP-1 cells, stimulate DC-SIGN-mediated HIV transmission

A number of studies examining interactions of dendritic cell (DC)-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin (DC-SIGN) with viral pathogens have relied on monocytic transfectants as models for primary DCs. Here we show that the presumed "THP-1" monocytic cells used in these studies are instead Raji B cells. Moreover, we demonstrate that true THP-1 cells do not support DC-SIGN-mediated HIV-1 transmission, whereas human B cell lines efficiently enhance this process. These data indicate that there are features common to B cells and DCs that facilitate transmission of HIV-1 and provide new insights toward the mechanism of DC-SIGN-mediated HIV-1 transmission.     

雷公藤内酯醇抑制Raji细胞增殖和迁移的体外实验研究

 目的： 研究雷公藤内酯醇在体外是否具有抗淋巴瘤细胞增殖和迁移的效应。方法： 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测雷公藤内酯醇对Raji细胞增殖的作用；采用Annexin V/PI双标流式细胞术检测雷公藤内酯醇对Raji细胞凋亡的影响；采用流式细胞仪检测雷公藤内酯醇对Raji细胞表面CXCR4受体表达的影响；并采用Transwell微孔隔离室迁移实验观察雷公藤内酯醇对Raji细胞体外迁移作用的影响。结果： ①雷公藤内酯醇能以时间和剂量依赖方式抑制Raji细胞的增殖，24 h和36 h的 IC50值分别为43.06 nmol/L和25.08 nmol/L。② 随雷公藤内酯醇药物浓度的增加和作用时间的延长，Raji细胞凋亡率逐渐增高，且呈时效和量效关系。③ Raji细胞经不同浓度雷公藤内酯醇（12.5、25、50 nmol/L）处理后，CXCR4表达率（34.66%±4.34%、23.74%±1.87%、18.10%±1.18%）明显低于对照组（72.47%±7.28%，P＜0.01），此抑制效应呈剂量依赖性；④ Transwell趋化活性分析显示雷公藤内酯醇能抑制rhSDF-1α对Raji细胞的趋化作用，此抑制效应也呈量效关系。结论： 雷公藤内酯醇具有抗淋巴瘤细胞增殖和诱导凋亡的效应，并能阻断Raji细胞的体外迁移，其机制与其对SDF-1/CXCR4生物学轴的抑制效应有关。     

基因c-IAP2和GAS1在何杰金及间变性大细胞淋巴瘤中表达

目的:检测凋亡相关基因c-IAP2和GAS1在何杰金氏淋巴瘤(HL)及间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)组织中的蛋白表达状况及差异,探讨此两种基因与HL和ALCL发生发展的相关性。方法:将288例恶性淋巴瘤标本经HE及CD30、CD15、CD20、CD45RO免疫组化染色,筛选出45例HL和ALCL,以免疫组化方法检测c-IAP2和GAS1在HL和ALCL中的表达,并进行统计分析。结果:①c-IAP2及GAS1分别在两组病例中的表达均有显著差异(P<0.05);②有两个病例为大小细胞混合型,c-IAP2和GAS1在大细胞的表达与HL一致,在小细胞的表达与ALCL类似。结论:c-IAP2、GAS1在HL和ALCL中的表达存在差异性,提示二者与此两种肿瘤的发生相关,HL和ALCL可能存在不同的发生机制及不同的信号转导途径受损部位;个别病例中存在着HL及ALCL两种瘤细胞的特点,表明HL和ALCL存在重叠和过渡;c-IAP2和GAS1的表达方式有助于HL及ALCL的鉴别诊断。     

pIRES2-EGFP-BCL11B真核表达载体体外表达的动态分析

目的: 研究真核表达载体pIRES2-EGFP-BCL11B(B细胞白血病/淋巴瘤11B基因)在K293(人胚肾细胞株)和Raji(人Burkitt 淋巴瘤细胞株)细胞中的表达情况。方法: 分别利用脂质体和核转染技术将真核表达载体pIRES2-EGFP-BCL11B(pBCL11B)转染至K293和Raji细胞中,并设立空质粒组(pI2)和空转染组(MOCK)作为对照。通过荧光显微镜和流式细胞仪检测转染后48 h各组EGFP的表达,确定转染效率。通过荧光实时定量PCR(Taqman)技术检测转染后24 h各组BCL11B mRNA的表达情况,通过Western blotting技术检测转染后48 h各组BCL11B蛋白的表达情况。高分辨率活细胞成像系统动态观察转染后36-72 h重组质粒在Raji细胞增殖过程中的表达。结果: K293细胞pBCL11B、pI2和MOCK组的转染效率分别为(71.23±4.62)%、(70.45±3.58)%和(0.30±0.10)%,而Raji细胞各组的转染效率分别为(23.12±5.94)%、(22.48±6.25)%和(0.30±0.10)%。实时定量PCR和Western blotting结果显示转染后pBCL11B组在mRNA和蛋白水平均能检测到 BCL11B 基因的有效表达,BCL11B的表达量均明显高于pI2组和MOCK组(P<0.05)。活细胞追踪显示转染后36-72 h重组质粒在细胞中可稳定表达且转染后的细胞可以正常分裂增殖。结论: 系统分析了真核表达载体pIRES2-EGFP-BCL11B转染至K293和Raji细胞的表达变化特点,转染后可以检测到该基因的有效上调,研究结果为下一步转染正常人T细胞奠定了基础。     

以人B淋巴细胞株Raji、人早幼粒白血病细胞株HL60为底物检测抗细胞膜DNA抗体在系统性红斑狼疮中的诊断价值

目的 比较以人B淋巴细胞株Raji、人早幼粒白血病细胞株HL60为底物检测抗细胞膜DNA抗体(抗cmDNA抗体)在系统性红斑狼疮(SLE)中的诊断价值.方法 分别以人B淋巴细胞株Raji、人早幼粒白血病细胞株HL60为底物,用间接免疫荧光法(IIF)检测306例SLE患者、192例疾病对照组患者、50例健康对照组血清中的抗cmDNA抗体.结果 以人B淋巴细胞株Raji为底物检测抗cmDNA抗体在306例SLE患者中阳性率为72.5%.而在脊柱关节病、类风湿关节炎、原发干燥综合征和其他结缔组织病中的阳性率分别为5.8%、10.0%、13.3%、15.0%.以人早幼粒白血病细胞株HL60为底物检测抗cmDNA抗体在306例SLE患者中阳性率为76.1%.而在脊柱关节病、类风湿关节炎、原发干燥综合征和其他结缔组织病中的阳性率分别为9.6%、11.1%、20.0%、22.5%.两种细胞为底物检测抗cmDNA抗体在健康对照组中阳性率均为0.抗cmDNA抗体阳性率在SLE组明显高于疾病对照组及健康对照组(P<0.01).以Raji及HL60两种细胞株为底物检测SLE患者抗cmDNA抗体,敏感性分别为72.5%和76.1%,特异性分别为91.7%和86.8%,差异均无统计学意义(P>0.05).Raji及HL60细胞培养、冻存及复苏方法相似,但Raji细胞较HL60细胞更易复苏.在荧光显微镜下观察,Raji细胞比HL60细胞表达效果更好.结论 抗cmDNA抗体是一种诊断阳性率较高的SLE血清学标记物之一.选择Raji细胞株为底物检测SLE患者的抗cmDNA抗体较HL60细胞株更有优势.

Abstract：

Objective To compare the significance of DNA-associated autoantibodies to cell membrane(cmDNA)in systemic lupus erythematosus(SLE)detected with indirect immunofluorescence on human B lymphoma cell line Raji and pmmyelocytic line HL60.Methods Indirect immunofluorescence assay both on cell line Raji and HL60 was used to measure anti-cmDNA antibodies in sera of 306 SLE patients.192 patients with other rheumatic diseases and 50 healthy controls.Results Indirect immunofluorescence assay on cell line Raji was used to measure anti-cmDNA antibodies.72.5% SLE and 10.4% other rheumatic diseases were positive for anti-cmDNA,but negative in 50 blood donors(P<0.01).Indirect immunofluorescence assay on cell line HL60 was used to measure anti-cmDNA antibodies,76.1% SLE and 16.7% other rheumatic diseases were positive for anti-cmDNA,but negative in 50 blood donors(P<0.01).The sensitivity of anti-cmDNA were 72.5%and 76.1%,respectively.The specificity of anti-cmDNA was 91.7% and 86.8%,respectively.There was no significant difference in sensitivity and spocificity(P>0.05).The methods of culture,freeze and resuscitation on the two cells were similar.but cell line Raji was easier to resuscitate than cell line HL60.Observing with fluorescence microscope.we find that cmDNA was expressed on the both cells and the staining was stronger on cellline Raji than HL60.Conclusion Anti-cmDNA antibody has high positivity which is one of the most valuable marker in the diagnosis of SLE.We recommend to measure anti-cmDNA antibodies with indirect immunofluorescence assay on cell line Raji rather than HL60.     

nm23-H1基因对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的抑制作用

目的:研究转染nm23-H1基因对体外培养A549细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机理。方法:构建nm23-H1基因的真核表达载体,转染到体外培养的人肺腺癌细胞A549中,通过G418筛选出稳定表达克隆,RT-PCR及免疫组化检测nm23-H1在细胞内的表达情况。绘制细胞生长曲线检测nm23-H1基因对细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期,原子力显微镜观察细胞膜表面伪足的超微结构。结果:转染后的肿瘤细胞能稳定表达nm23-H1基因,抑制了肿瘤细胞的增殖。nm23-H1基因没有诱导细胞凋亡但使G1期细胞增加而S期细胞减少,停滞于G0期。转染nm23-H1基因后细胞边缘的伪足减少。结论:nm23-H1基因能抑制体外培养的A549肿瘤细胞的增殖,可能通过改变细胞表面结构减弱细胞的侵袭能力。     

DAPK1基因开放读码序列的克隆、序列分析及诱导Raji细胞凋亡

目的:探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK1)在肿瘤的形成、转移中所起作用,克隆DAPK1基因的开放读码序列(ORF)。方法: 根据GenBank提供的核苷酸序列,自行设计引物,用RT-PCR从K562细胞中扩增DAPK1基因的ORF;用质脂体将pcDNA3.1(+)-DAPK1转染到Raji细胞,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,MTT法观察DAPK1基因对细胞生存的影响。 结果:DAPK1基因的ORF克隆到质粒pMD18-T,测序鉴定;分析结果显示,从K562细胞成功扩增4 300 bp的DAPK1基因ORF有7处突变,其中6处是同义突变,1处是基因的单链核苷酸多态性;DAPK1基因的ORF克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化到Raji细胞;转染48 h后,可以检测到DAPK1的表达,并可以观察到细胞发生凋亡。结论:大片段的基因可以采用RT-PCR法直接克隆,采用常规的转染技术可以将大片段基因转染到宿主细胞;成功克隆具有活性功能DAPK1基因ORF,过表达的DAPK1基因可以诱导Raji细胞凋亡。