骨髓间充质干细胞软骨分化生物学的影响因素

间充质干细胞(MSCs)因具有在适宜的体内或体外条件下分化形成软骨组织的潜能，且易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化，便于自体移植，故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。然而，MSCs在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程。目前其调控机制仍不是很清楚。已知局部环境是影响MSCs向软骨细胞转化的重要因素，低氧张力、高细胞密度、局部应     

骨髓间充质干细胞成软骨分化研究进展

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，在特定的培养条件下，MSCs可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种间充质细胞。由于它们可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。本文就骨髓MSCs的分离培养及成软骨分化的研究进展作一综述。     

Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

[目的]探讨Wnt3a基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。[方法]分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),携带Wnt3a及阴性对照基因(Mock)的慢病毒感染骨髓间充质干细胞,构建过表达Wnt3a骨髓间充质干细胞;采用甲苯胺蓝染色及QPCR观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响;使用MTT法观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。[结果]在0~72 h内,实验组MTT法检测吸光值明显大于对照组(P0.05);BMSCs体外成软骨诱导后,实验组细胞团明显小于对照组,且甲苯胺蓝染色较浅;实验组与对照组比较,成软骨指标Col2A1、Aggrecan和SOX9的m RNA表达降低(P0.05)。[结论]Wnt3a可促进骨髓间充质干细胞增殖,但抑制了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。     

不同环境刺激对骨髓间充质干细胞成软骨分化作用的研究进展

损伤和骨关节炎常常导致关节软骨的退变.关节软骨缺乏血管和神经,其自身修复能力很有限.软骨细胞被包裹在软骨基质里,不容易迁移到损伤区域参与修复,因此损伤的关节软骨很少能自愈.治疗关节软骨损伤的方法包括关节镜灌洗术、磨削关节成形术、微骨折术、自体细胞移植术等[1-2].尽管这些方法可以减轻病人的疼痛并在一定程度上改善关节功能,但没有能够使关节软骨完全再生,并且远期临床效果也不尽人意[3].     

MicroRNAs在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用

软骨组织由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成,由于缺乏血管?神经和淋巴系统,损伤后自身修复能力差。目前各种促进软骨损伤修复的方法效果都不理想,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化修复软骨损伤已成为当下研究的热点。多种MicroRNA参与并调控骨髓间充质干细胞成软骨分化过程,本文就MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成软骨分化及其机制的研究进展做一综述。     

骨髓间充质干细胞及在软骨组织工程中的研究进展

间充质干细胞 (ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ)是指能在适宜的条件下分化再生骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪、骨髓基质等间充质组织的一类细胞 ,具有典型的干细胞特点 ,终身存在于骨髓和其他组织器官中 ,负责组织的修复和更新〔1,2〕。它们具有多向分化潜能和强大的增殖能力 ,并且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化 ;因此 ,近年来在组织工程领域倍受重视 ,得到广泛研究。笔者仅就骨髓间充质干细胞的生物学特性及其在软骨组织工程中的研究进展作一综述。1　骨髓间充质干细胞的主要生物学特性　　骨髓中只含有少量间充…     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

生长分化因子5诱导人骨髓间充质干细胞微团成软骨分化的研究

[目的]探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)微团成软骨分化的可行性及效果。[方法]体外分离培养hMSCs,取第3代细胞实验。将hMSCs分别用无血清H-DMEM和含10、20、50、100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液(chondrogenic medium,CM)诱导,显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测各组细胞的增殖情况。诱导2周后重悬细胞,以5×106/ml的细胞密度离心构建微团,继续诱导2周。RT-PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达。免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达。[结果]hMSCs呈梭形、漩涡状生长。100 ng/ml GDF-5诱导的hMSCs呈圆形或多角形。五组微团分别由无血清H-DMEM、含10,20,50,100 ng/ml GDF-5的软骨诱导液诱导2周后,除H-DMEM组无Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达外,其他各组Ⅱ型胶原mRNA、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的表达呈...     

骨髓间充质干细胞分化为神经细胞研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为神经细胞的研究旨在诱导分化出具有分泌神经递质和电生理功能的成熟神经细胞,并提高神经细胞分化率.细胞因子诱导、中药及其提纯物诱导、细胞共培养诱导及提高细胞内环磷腺苷诱导等方案有助于BMSC分化为神经细胞,但体内实验诱导分化率远较体外实验低.不同浓度的细胞因子有不同的诱导分化率,中药及其提...     

骨髓间充质干细胞及其在软骨组织缺损修复中的研究进展

软骨缺损长期以来一直是临床上所面临的难题,这主要是因为软骨细胞几乎没有迁徙能力,不能迅速聚集到创伤部位所致〔1〕。组织工程技术为软骨缺损的修复带来了曙光。它通过分离及培养所需的种子细胞、选择适合的生物支架材料、最后构建组织工程化软骨到缺损部位而完成治疗目的。目前,常用的用于修复软骨损伤的种子细胞多为自身软骨细胞,但有如下缺点:( 1)自体来源的软骨细胞数量有限,且随着年龄增大所获取得软骨细胞数量减少;( 2 )取材不方便,对供体部位造成一定的伤害;( 3 )患者要经历两次手术,所受痛苦大,治疗费用高。这就迫使人们寻找更为…     

骨髓间质干细胞向软骨细胞表型定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的猪骨髓间质干细胞（Bone Marrow Stem Cells,MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法 取成年崇明长枫杂交猪髂骨骨髓5ml，在低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以高糖DMEM无血清特定培养液诱导（含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF－β1 10ng/ml)，在相关显微镜和电镜下进行观察，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形转变，透视电镜观察见大量扩张粗面内质网、高尔基体、线粒体。诱导培养后第7，14dⅡ型胶原免疫组化阳性，同时原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达呈阳性。结论 MSCs在特定培养液诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软膏特异性基质，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源的应用前景。     

体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展

目的全面了解目前体外诱导BMSCs向软骨分化的方法,为软骨组织工程研究提供参考。方法广泛查阅近年来有关软骨组织工程中诱导BMSCs向软骨分化的文献,并进行综合分析。结果目前BMSCs诱导成软骨方法主要是添加外源性生长因子,其中TGF-β家族被公认为最重要的诱导和调节因子。其他重要的诱导方法包括添加多种化学因子、物理因素、转基因技术和微环境诱导等方法,但这些方法仍存在诱导效率低、诱导效果不稳定的问题。结论诱导方法的进展促进了BMSCs在软骨组织工程中的应用,建立更高效、简便、安全的诱导方法仍是软骨组织工程领域重要研究课题之一。     

生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究

目的探讨生长分化因子7(growth differentiation factor7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌腱细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据。方法采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力。取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0ng/mL),分为A、B、C、D组。体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达。结果经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力。实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P<0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P<0.05),tenascin C mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P<0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P<0.05);D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达;除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异。Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达。结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化。     

脊索细胞培养基促进BMSCs增殖分化的研究

目的为研究椎间盘组织工程种子细胞,观察脊索细胞培养基对BMSCs增殖分化的影响。方法取4周龄日本大耳白兔胸腰段椎间盘分离培养脊索细胞,取双侧股骨分离培养BMSCs,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养脊索细胞,5 d后制备脊索细胞培养基。实验分为两组,实验组BMSCs中加入脊索细胞培养基培养,对照组BMSCs中加入含15%FBS的DMEM/F12培养基培养。使用细胞活力细胞毒性检测检测细胞增殖情况,采用免疫荧光及实时荧光定量PCR检测BMSCs蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达情况。结果成功分离脊索细胞及BMSCs。细胞增殖检测示,培养5、7、9、14 d,实验组细胞数量明显多于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测示对照组培养7、14 d细胞内均无或者有较少Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达,实验组二者均有较多表达,且培养14 d时表达明显多于7 d。实时荧光定量PCR检测示,培养7、14 d实验组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组14 d蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于7 d(P<0.05)。结论脊索细胞培养基可促进BMSCs增殖,并诱导BMSCs向类软骨细胞分化,为脊索细胞和BMSCs作为种子细胞治疗椎间盘退变提供了依据。     

红景天苷对大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的影响

目的探讨传统中药红景天苷诱导大鼠BMSCs向胆碱能神经细胞分化的作用及影响,以期为红景天苷应用于干细胞治疗神经系统疾病提供理论依据。方法取4～6周龄Wistar大鼠(体重约120 g)2只分离、培养BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定。取第2代细胞,根据诱导方法不同将实验分为红景天苷诱导组(A组)、维甲酸诱导组(B组)和空白对照组(C组),A、B组BMSCs分别采用红景天苷(20μtg/mL)和维甲酸(5μmol/mL)诱导培养1、3、6、9 d,MTT法检测细胞增殖活力;细胞免疫荧光染色检测神经细胞相关标志分子神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、神经微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)及NGF的表达;RT-PCR检测NSE、β-TubulinⅢ、GFAP、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)mRNA的表达;ELISA法测定培养液中BDNF和NGF含量;Western blot检测NGF蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测显示,CD90和CD106阳性,CD34和CD45阴性,实验细胞为BMSCs。A、B组诱导培养6 d和9 d,细胞增殖活力较C组明显增强(P<0.05)。RT-PCR检测示,A组诱导培养6 d,NSE、BDNF、β-TubulinⅢ、GFAP mRNA表达丰度上调至峰值。B组诱导培养6 d,NSE mRNA表达丰度上调至峰值;1 d时BDNF mRNA表达丰度上调,6 d时达峰值;3 d时β-TubulinⅢmRNA表达丰度上调至峰值;1 d时GFAP mRNA表达丰度达峰值,与其余各时间点及C组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。各组各时间点均未见GABA mRNA表达。细胞免疫荧光染色示,诱导培养3 d,A、B组NSE、MAP2、β-TubulinⅢ和GFAP阳性率与C组比较差异均有统计学意义(P<0.01);A、B组诱导培养3、6、9 d,Ach阳性率均高于诱导培养1 d时及C组阳性率(P<0.01);A、B组各时间点NGF阳性率均显著高于C组(P<0.01)。ELISA法检测显示,A、B组诱导培养1、3、6、9 d时,BDNF、NGF表达水平均较C组上调(P<0.01),各时间点A、B组间BDNF表达水平比较差异无统计学意义(P<0.01)。Western blot检测显示,A组诱导培养6 d、B组诱导培养3 d时NGF蛋白表达最高。结论红景天苷能定向诱导大鼠BMSCs分化为胆碱能神经细胞。     

骨髓间充质干细胞的贴壁培养及内毒素对其增殖活性的影响

目的贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察不同浓度内毒素对其增殖活性的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法培养大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞CD44、CD29、CD34的表达,流式细胞术检测细胞周期。加不同浓度的内毒素(0、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用24h,用四唑盐比色法(MTT)检测BMSCs的增殖。结果分离培养的细胞三代以后呈均一的成纤维细胞样形态,高表达CD44,但不表达CD34、CD45。80%以上的第三代BMSCs处于G1期。不同浓度的LPS作用24h后各组的平均吸光度值(A)比较有统计学意义(F=3.598,P=0.007);0.01μg/mlLPS组A值与其余各组相比,具有统计学意义(P0.05)。结论全骨髓贴壁培养法可以方便、快捷地获得BMSCs,其在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性;0.01μg/mlLPS可明显促进BMSCs的增殖。     

同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及相关基因表达的影响

目的 观察低频振动对小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的影响。方法 取3周龄C57BL/6小鼠,分离及培养其BMSCs。将细胞分为两组,对照组及低频振动组,两组均诱导BMSCs进行成骨分化,低频振动组在诱导过程中实施低频振动干预（15 Hz,垂直加速度0.3 g）,对照组不进行干预,分别于第7天、第14天收获细胞,将第7天的细胞进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色,将第14天的细胞进行茜素红染色;并利用Real-time PCR检测相关基因表达。结果 低频振动组细胞第7天的ALP活性明显高于对照组,且在14 d形成的钙结节多于对照组;所检测基因中,低频振动组细胞Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、骨保护素基因的表达均高于对照组,而破骨细胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）较对照组低。结论 低频振动可以促进BMSCs的成骨分化,并调节成骨细胞分泌的细胞因子,影响破骨细胞的生成。