蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对去血清培养诱导的293T细胞凋亡的作用

目的：探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP－2对去血清培养诱导人胚肾293T细胞凋亡的作用。方法:将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2(WT)野生型及pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体通过脂质体法转染293T细胞，MTT测定去血清培养对293T细胞增殖的抑制情况，去血清培养293T细胞3 d后，电镜观察超微结构、流式细胞仪检测细胞凋亡率、免疫组织化学方法测定caspase-3表达。结果:去血清培养293T细胞3 d，转染pIRES-GFP-SHP-2(WT)野生型组的293T细胞凋亡率明显低于对照组和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体组；而2转染组超微结构均发生早期凋亡，但并无明显差异；caspase-3免疫组化结果显示SHP-2(WT)野生型组的caspase-3表达率明显低于SHP-2C459S突变体组。结论:SHP-2可能参与到去血清培养诱导细胞凋亡的信号转导通路中并通过caspase-3依赖途径，对细胞的生存起到正向调节作用。     

Rho激酶在血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用

目的： 探讨Rho激酶在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激心肌成纤维细胞（CFBs）增殖和胶原合成中的作用。方法： 采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生Sprague-Dawley (SD) 大鼠CFBs，并用AngⅡ诱导CFBs增殖和胶原合成。采用四氮唑盐（MTT）比色法测定细胞增殖,羟脯氨酸法测定CFBs胶原含量, RT-PCR检测Rho激酶mRNA表达，Western blotting检测肌球蛋白结合亚基磷酸化（MBS-P）表达作为Rho激酶功能活化的标志。结果：（1）AngⅡ（10-７ mol/L）刺激48h可诱导CFBs增殖和胶原合成(均P<0.01)；（2) AngⅡ（10-7 mol/L）可显著上调新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA表达并诱导Rho激酶快速活化；（3）在一定浓度范围内，Rho激酶特异性抑制剂hydroxyfasudil (H4413)对AngⅡ（10-7 mol/L）刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论： AngⅡ可诱导新生SD大鼠CFBs的Rho激酶mRNA转录并活化Rho激酶，抑制Rho激酶活化对AngⅡ刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用，提示Rho激酶在调控AngⅡ刺激大鼠CFBs增殖与胶原合成中可能具有重要作用。     

AngⅡ对心肌成纤维细胞的作用及其胞内信号转导通路

血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )作用于心肌成纤维细胞表面的相应受体 ,主要通过细胞内丝裂素活化蛋白激酶 (MAPKs)及信号转导与转录激活因子 (STATs)信号转导通路 ,对心肌成纤维细胞的增殖和胶原代谢进行调节。AngⅡ的促心肌细胞肥大作用主要是通过心肌成纤维细胞以旁分泌的形式介导的。     

Ang Ⅱ对成年大鼠心肌成纤维细胞分泌ET-1、NO功能的影响

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）对成年大鼠心肌成纤维细胞（MFs）分泌内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）的影响。方法：采用酶消化法和差速贴壁分离法获取MFs，应用放射免疫分析法、硝酸还原酶法分别测定不同条件下培养的第二代心肌MFs培养液中的ET-1、NO水平。结果：一定浓度范围内的Ang Ⅱ可按剂量依赖方式促MFs分泌ET-1, 血管紧张素Ⅱ1型受体（AT₁R）拮抗剂losartan可阻断Ang Ⅱ的上述作用；Ang Ⅱ可抑制心肌MFs分泌NO，加losartan后再加Ang Ⅱ培养发现，MFs分泌NO能力不但不降低，而且还高于对照组（P<0.01）。结论：Ang Ⅱ可通过AT₁R促成年大鼠心肌MFs分泌ET-1，主要通过AT₁R影响MFs分泌NO，从而改变ET-1/NO比值。Ang Ⅱ可能通过影响MFs分泌的生物活性物质网络平衡关系改变，发挥其促心肌肥厚及心力衰竭效应。     

血管紧张素Ⅱ刺激肥大心肌细胞和心肌成纤维细胞核酸蛋白质…

本实验用压力和容量超负荷性分离的肥大心肌细胞及培养的心肌成纤维细胞，就血管紧张素Ⅱ可提高正常和两种肥大ＭＣ的＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－Ｐｒｏ掺入率的影响了对比研究。     

蛋白酪氨酸激酶与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体信号转导

血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）受体虽然缺乏内源性蛋白酷氨酸激酶活性,但它却细胞内信号转导的磷脂酶Ｃ－磷酸肌醇途径、酶蛋白受体－Ｒａｓ途径和ＪＡＫ／ＳＴＡＴ途径中多种信号分子,及其受体本身和粘着斑激酶等分子的酷氨酸磷酸化密切相关。蛋白酷迄酸磷酸化是细胞转导生长与分化信号的重要机制。本文叙述血管平滑肌细胞和心脏细胞在ＡｎｇⅡ受体各信号转导途径中的蛋白酷氨酸磷酸化现象。     

Ang-Ⅱ对大鼠胚心成纤维细胞的影响

目的：探讨血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)对大鼠胚心成纤维细胞(FB)的促增殖作用和促胶原蛋白合成作用及其机制。方法： 应用同位素掺入技术，检测Ang-Ⅱ对体外大鼠胚心FB的促增殖和促胶原蛋白合成作用，并应用放射自显影和荧光法，检测FB上的Ang-Ⅱ受体分布和细胞内游离Ca2+浓度。结果： Ang-Ⅱ使FB ［3H］TdR和［3H］脯氨酸的掺入率明显增加，放射自显影显示在细胞表面有大量银颗粒出现，图像分析显示膜上受体银颗粒在竞争抑制组明显少。细胞内游离Ca2+浓度较高。结论： Ang-Ⅱ有刺激大鼠胚心FB增殖和胶原蛋白合成作用， 大鼠心肌FB膜上有Ang-Ⅱ受体，受体磷酸化后 ，通过细胞内游离Ca2+浓度增加等一系列细胞内信号系统的活化，出现FB的增殖和胶原蛋白合成。     

肌肽对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的 研究肌肽(carnosine)对高糖环境下大鼠心脏成纤维细胞(cardiac flbroblasts,CFs)增殖的影响及机制.方法 以CFs为研究对象,使用Brdu-酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immu-nosorbent assays,ELISA)检测法观察肌肽抑制高糖环境下心肌成纤维细胞DNA的合成;细胞周期的测定采用流式细胞仪法;Western blot法观察不同条件下CFs中CDK2、CyclinE、PCNA、ERK1/2、p-ERK1/2及p21和p27的蛋白表达情况.结果 肌肽能够抑制高糖环境下CFs的DNA合成,通过调节细胞周期和细胞周期的相关蛋白表达来实现这种作用.与高糖组比较,20 mmol/L肌肽组明显抑制了高糖刺激的大鼠CFs中CDK2、CyclinE、PCNA蛋白的表达增加(t CDK2=6.19、t CyclinE=5.7、t PCNA=8.56,P<0.05),差异具有统计学意义;与高糖组比较20 mmol/L肌肽则使p21、p27表达水平增加了(t p21=5.16、t p27=8.558,P<0.05),具有统计学意义;与高糖组比较20 mmol/L的肌肽或20 mol/L的PD-98059(ERK1/2抑制剂)明显抑制了高糖刺激的大CFs中p-ERK1/2的表达增加(t肌肽=5.64、t PD=8.68,P<0.05),差异具有统计学意义.结论 肌肽能够通过ERK1/2 MAPK信号通路抑制高糖环境下心肌成纤维细胞的DNA合成.     

心肌成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下表达下调基因的分离和鉴定

目的：对成年大鼠心肌成纤维细胞（CF）受血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激后下调基因表达谱进行筛选及分析。 方法： 以受AngⅡ刺激CF为驱动方，未刺激CF为实验方，进行抑制消减杂交（SSH）建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将部分阳性克隆测序及进行同源性分析。 结果： 共获得17条下调表达基因，分别与胞内信号转导、转录抑制、纤维沉积和细胞骨架重构相关，并克隆到4条新基因表达序列标签（EST）。 结论： SSH有效地克隆了成年大鼠CF受AngⅡ刺激后下调表达基因，对这些基因的研究将有助于阐明心肌改建的分子机制。     

AngⅡ对ECV304细胞增殖作用的相关基因表达谱研究

目的 :探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱。方法 :体外培养人脐静脉内皮细胞株 (ECV3 0 4) ,实验分AngⅡ处理组、NAC干预组和正常对照组。采用改良MTT法、Fen ton反应和硝酸酶还原法分别观察不同浓度AngⅡ在4h、1 2h和 2 4h时对ECV3 0 4细胞的增殖率和细胞产生ROS(·OH和NO)的量。应用基因芯片技术和光镜分别检测 0 .0 62 5和 1 μmol/LAngⅡ作用 1 2h时ECV3 0 4细胞增殖作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。结果 :实验结果发现 :①一定浓度的AngⅡ(0 .0 3 1 2 5～ 1 μmol/L)作用 1 2h时E…     

Ang—Ⅱ对血缺氧性心肌胶原代谢的影响

目的：探讨缺血缺氧性心肌损伤过程中血管紧张素－Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）与心肌胶原代谢的关系。方法：是丙基肾上腺素（ＩＳＰ）注射大鼠、造成心肌缺血缺氧和心肌坏死模型,检测血清内ＧＯＴ、ＣＫ、ＬＤＨ、ＨＢＤＨ（羟丁酸脱氢酶）的活性,并检测心肌组织内血管紧张素－Ⅰ转换酶（ＡＣＥ）、血管紧张素－Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）和心肌胶原含量变化,观察细胞外间质效应细胞增殖情况。结果：注射ＩＳＰ后,血清ＧＯＴ、ＣＫ、ＬＤＨ、ＨＢＤ     

血管紧张素Ⅱ对心肌梗塞大鼠成纤维细胞的核酸、胶原合成影响的研究

目的和方法：本实验利用酶法分离、培养成年大鼠心肌成纤维细胞（Ｆｂｓ），观察了血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）在不同处理因素下对Ｆｂｓ的３Ｈ－ＴｄＲ、１４Ｃ－ＵＲ、３Ｈ－Ｐｒｏ掺入率的影响。结果：在相同浓度（１０７ｍｏｌ／Ｌ）ＡｎｇⅡ作用下，ＭＩ组Ｆｂｓ对上述３种标记底物的掺入率均显著高于假手术（ＳＯ）组（Ｐ＜０．０５）。ＡｎｇⅡ的上述作用，可被特异性ＡｎｇⅡ拮抗剂［１８］ＡｎｇⅡ和血管紧张素抗肽（Ａｎｇ－ＡＰ）完全阻断，却不能被Ｌｏｓａｒｔａｎ完全阻断。结论：ＡｎｇⅡ可直接作用于心肌Ｆｂｓ，促进Ｆｂｓ的ＤＮＡ、ＲＮＡ和胶原蛋白的合成。ＭＩ组大鼠Ｆｂｓ对ＡｎｇⅡ反应性显著高于ＳＯ组，介导ＡｎｇⅡ对Ｆｂｓ的作用除ＡＴ１外，可能还有其他机制参与     

血管紧张素Ⅱ刺激肥大心肌细胞和心肌成纤维细胞核酸蛋白质及胶原合成

本实验用压力（ＰＯ）和容量超负荷（ＶＯ）性分离的肥大心肌细胞（ＭＣ）及培养的心肌成纤维细胞（Ｆｂｓ），就血管紧张素（Ａｎｇ）Ⅱ对其￣３Ｈ－Ｌｅｕ，￣１４Ｃ－ＵＲ，￣３Ｈ－ＴｄＲ和￣３Ｈ－ｐｔｏ掺入率的影响进行了对比研究。发现尽管ＡｎｇⅡ可提高正常和两种肥大ＭＣ的￣３Ｈ－Ｌｅｕ和￣１４Ｃ－ＵＲ掺入率，但肥大ＭＣ增加幅度显著高于假手术对照（ＳＯ）组，尤其以ＶＯ组最为明显（Ｐ＜０．０５ｖｓＰＯ）。相反，ＰＯ组ＦｂＳ的￣３Ｈ－ＴｄＲ，￣１４Ｃ－ＵＲ和￣３Ｈ－Ｐｒｏ掺入率增加幅度又显著高于ＳＯ和ＶＯ组。除￣３Ｈ－Ｐｔｏ外，ＶＯ组的￣３Ｈ－ＴｄＲ及￣１４Ｃ－ＵＲ掺入率与ＳＯ组相比差异无显著性。表明ＡｎｇⅡ对两种肥大心肌的ＭＣ和Ｆｂｓ的核酸、蛋白质及胶原合成的促进作用存在明显差异。提示：ＡｎｇⅡ的这种作用可能是导致压力和容量超负荷性心肌肥大时，心肌实质细胞与胶原增生出现不同步发展的主要和直接原因之一。     

血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响

目的:观察血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响.方法:血管紧张素Ⅱ作用于培养的大鼠血管外膜成纤维细胞,采取酶联免疫吸附法(ELISA)、竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达.结果:在血管紧张素Ⅱ作用下,血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达均增加,且有一定的剂量依赖性.结论:血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达,提示血管紧张素Ⅱ是调节血管外膜成纤维细胞胶原代谢的重要因子,血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程.     

反义N-ras1基因抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖和肥大

目的 探讨逆转录病毒介导的Ｎ－ｒａｓ１基因对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞增殖和肥大的抑制作用。及其应用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法 将重组逆转录病毒反义Ｎ－ｒａｓ１基因体外转染乳鼠心肌细胞,应用ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测基因表达情况,应用细胞计数（＾３Ｈ）－ＴｄＲ掺入及细胞体积检测手段,观察Ｎ－ｒａｓ１基因对心肌细胞增殖及肥大的抑制作用。结果 逆转一贯功体能将外源性基因导入心肌细胞并     

血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响

目的:观察血管紧张素Ⅱ对血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原合成及其mRNA表达的影响。方法:血管紧张素Ⅱ作用于培养的大鼠血管外膜成纤维细胞,采取酶联免疫吸附法(ELISA)、竞争性逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果:在血管紧张素Ⅱ作用下,血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达均增加,且有一定的剂量依赖性。结论:血管紧张素Ⅱ可刺激血管外膜成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成及Ⅰ型胶原mRNA的表达,提示血管紧张素Ⅱ是调节血管外膜成纤维细胞胶原代谢的重要因子,血管外膜成纤维细胞可能参与高血压血管重塑过程。     

干扰素诱导蛋白16对人脑血管外膜成纤维细胞增殖与迁移的影响及其机制

 目的：研究干扰素诱导蛋白16(IFI16)对人脑血管外膜成纤维细胞（HBVAFs）增殖与迁移的影响及其可能机制。方法：在HBVAFs中转染针对IFI16基因的小分子干扰 RNA (siRNA) 48 h后, 用2×106 U/L 干扰素-α（IFN-α）处理转染IFI16 siRNA细胞24 h。流式细胞术测定细胞周期,细胞划线法与Transwell法测定细胞迁移能力。应用 real-time PCR法和蛋白免疫印迹 (Western blotting) 法分别测定细胞中 IFI16、p53及p21 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果：转染IFI16 siRNA后,HBVAFs中IFI16、p53及p21 mRNA和蛋白表达水平下调,增加了细胞G1/S期转换。IFN-α可诱导HBVAFs中IFI16、p53及p21mRNA和蛋白表达水平上调,同时抑制细胞G1/S期转换与细胞迁移,但在转染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到抑制。结论：IFI16表达可以抑制HBVAFs增殖和迁移,其机制可能与激活p53和p21的表达有关。     

NO和AngⅡ对大鼠心室重构影响的实验研究

目的:探讨压力超负荷心肌肥大反应过程中心肌内分泌因子活动及相互间的作用。方法:利用腹主动脉缩窄性高血压大鼠模型,以平均动脉压(MAP)、心系数(LVW/BW)及心肌体积密度(VV)、表面积密度(SV)、比表面(S/V)及平均自由程(λ)等体视学参数作为指标,观察一氧化氮(NO)及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在压力超负荷高血压和心肌肥大反应过程中的作用及其相互关系。结果:腹主动脉缩窄的大鼠,其MAP、LVW/BW明显增高,心肌横断面积及平均直径明显增大,VV、SV、S/V及λ等与对照组相比均有显着性差异;NO前体L-Arg和AngⅡAT1受体拮抗剂Los能明显阻断腹主动脉缩窄大鼠的MAP、LVW/BW的增高效应,心肌横断面积、平均直径及VV、SV等明显变小,S/V及λ则增大;用NOS抑制剂L-NAME处理的腹主动脉缩窄大鼠,其MAP、LVW/BW值则进一步增高,心肌横断面积、平均直径及VV、SV等参数持续加大,而S/V及λ则变小。结论:NO和AngⅡ参与了腹主动脉缩窄后的高血压和心肌肥大反应。NO的降血压、抑制心肌肥大作用可能是通过降低AngⅡ的浓度来实现的。     

Ang-Ⅱ对缺血缺氧性心肌胶原代谢的影响

目的：探讨缺血缺氧性心肌损伤过程中血管紧张素－Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）与心肌胶原代谢的关系。方法：用异丙基肾上腺素（ＩＳＰ）注射大鼠,造成心肌缺血缺氧和心肌坏死模型,检测血清内ＧＯＴ、ＣＫ、ＬＤＨ、ＨＢＤＨ（羟丁酸脱氢酶）的活性,并检测心肌组织内血管紧张素－Ⅰ转换酶（ＡＣＥ）、血管紧张素－Ⅱ（Ａｎｇ－Ⅱ）和心肌胶原含量变化,观察细胞外间质效应细胞增殖情况。结果：注射ＩＳＰ后,血清ＧＯＴ、ＣＫ、ＬＤＨ、ＨＢＤＨ活性增加,心肌匀浆内ＡＣＥ、Ａｎｇ－Ⅱ含量上升,并发现在ＡＣＥ、Ａｎｇ－Ⅱ升高的同时有成纤维细胞的增生,以后心肌胶原含量明显升高。结论：心肌缺血缺氧后,心肌局部合成释放ＡＣＥ、Ａｎｇ－Ⅱ增加,使心肌成纤维细胞增殖和合成胶原能力增强,出现心肌胶原含量的增加。说明Ａｎｇ－Ⅱ是心肌间质胶原反应的一个信号分子     

AngⅡ/AT_1R通路下调内皮型一氧化氮合酶磷酸化的机制研究

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT_1R)通路通过激活蛋白磷酸酶2 A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)导致大鼠肠系膜动脉中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)磷酸化水平下调的机制。方法:采用体重160~180 g成年雄性SD大鼠90只,在无菌条件下分离大鼠肠系膜动脉。首先明确AngⅡ下调大鼠肠系膜动脉中e NOS(Ser1177)磷酸化的效应,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组和AngⅡ组,AngⅡ组用浓度为1×10~(-7)mol/L、1×10~(-6)mol/L和1×10~(-5)mol/L AngⅡ分别孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h;然后进一步探讨AngⅡ使eNOS(Ser1177)发生磷酸化下调的分子机制,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组、AngⅡ组和坎地沙坦(candesartan,CAN;AT_1R特异性抑制剂)+AngⅡ组(用1×10~(-5)mol/L CAN预处理大鼠肠系膜动脉血管1 h后,再用1×10~(-7)mol/L AngⅡ继续孵育12 h)。采用Western blot法检测肠系膜动脉中eNOS蛋白表达和eNOS(Ser1177)磷酸化水平,以及PP2Ac的蛋白表达、PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I~2~(PP2A)的表达水平,并用PP2A活性检测试剂盒测定大鼠肠系膜动脉PP2A活性变化。结果:(1)与control组比较,AngⅡ孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平均明显降低(P0.05),且12 h组和24 h组eNOS(Ser1177)磷酸化水平下降均出现明显浓度依赖性,但不同浓度组间eNOS蛋白表达水平差异均无统计学显著性;(2)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平降低(P0.05);CAN预处理可明显上调eNOS(Ser1177)磷酸化水平(P0.05),且各组间eNOS蛋白表达水平差异无统计学显著性;(3)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和I_2~(PP2A)蛋白表达均降低(P0.05);CAN预处理可使PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和IPP2A2蛋白表达均增加(P0.05),但各组间PP2Ac蛋白表达的差异无统计学显著性;(4)与control组比较,1×10~(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2A活性增高(P0.05);CAN预处理可明显抑制AngⅡ对PP2A的激活作用(P0.05)。结论:AngⅡ可通过AT1R通路激活PP2A,从而介导大鼠肠系膜动脉eNOS(Ser1177)磷酸化水平下调,其分子机制可能与PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I_2~(PP2A)表达降低有关。